Transcription is an essential process implicated in the cell maintenance and homeostasis, but also specific cell processes like differentiation, stress adaptation and development. This process is regulated by many layers of control, from the transcriptional machinery, the chromatin landscape until the genome organization. However, the first events leading to transcription is the binding of transcription factors (TFs) on enhancers or at the distal promoter, with as a downstream consequence the recruitment of the RNA Polymerase II. In the recent years, TFs have been demonstrated to form cluster in vitro and in vivo at enhancers and target genes. Studies have suggested that clustering activators such as TFs could increase DNA binding by confinement, help to recruit other TFs or co-activators or bring enhancers and promoters together. Moreover, it has been suggested that the amount of TF inside these clusters is correlated with transcription initiation and bursting, but how this is regulated is still unclear. However, these studies are mostly done in cells, with artificially induced clustering or using artificial DNA array as a seed.
Here, I take the advantage of Nanog clusters colocalizing with the mir430 locus transcription during zygotic genome activation in zebrafish embryo to study how the dynamics of Nanog clusters correlates with mir430 transcription initiation. Using a live-imaging approach, I studied how the Nanog clusters positive for mir430 transcription relates quantitatively and mechanistically to mir430 transcription.
I have found that Nanog make multiple clusters in the nucleus, two of which only transcribed as such early stage and colocalize with mir430 transcription. The Nanog clusters positive for mir430 transcription contains more proteins than other Nanog clusters. Interestingly, the Nanog clusters regulating mir430 transcription is formed by two mechanisms: growth and merging of smaller Nanog clusters. I observed that transcription at the mir430 locus starts when the Nanog cluster is reaching a peak of Nanog amount, suggesting a threshold amount of Nanog for transcription initiation. Intriguingly, the merging of smaller Nanog clusters is important to increase Nanog amount locally and reach such a threshold. Using live DNA labelling, I found that the merging Nanog clusters are both seeded by the mir430 locus and that merging of the Nanog was concomitant with mir430 local compaction prior to transcription initiation. Notably, Nanog is not necessary for the mir430 locus compaction but is important for keeping the DNA together once compaction occurred.
To conclude, these results suggests that the amount of Nanog above a critical threshold inside clusters is important for transcription initiation of the mir430 locus. Local mir430 compaction helps to reach such high levels of Nanog locally by merging of smaller clusters. These findings help to understand how TF clustering is influencing transcription initiation, by reaching a threshold amount of TFs.
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La transcription est un processus cellulaire de base qui implique la plupart des autres processus cellulaires. Chez les eucaryotes, la transcription se passe dans le noyau où l’ARN Polymérase II transcript les genes codant pour des proteins et des microARNs pour permettre l’expression du génome dans la cellule. Ce processus est régulé par de nombreux niveaux de régulation, de la machinerie de transcription, en passant par l’architecture de la chromatin jusqu’à l’organisation du génome. Cependant, la transcription commence toujours par la fixation de facteurs de transcription (FTs) sur des activateurs ou la partie distale du promoteur, ce qui a pour conséquence le recruitement de l’ARN Polymérase II. Récemment, il a été démontré que les FTs forment des accumulations in vitro et in vivo. Cependant, the role de ces accumulations dans la régulation de la transcription reste encore incertain.
Certaines récentes études ont montré que l’accumulation locale de FTs ou de co-activateurs augmentait la fixation sur l’ADN à cause du confinement, aidait à recruiter d’autres FTs ou co-activateurs, ou permet de localiser les activateurs et les promoteurs localement. De plus, il a été suggéré que le niveau de FT dans ces accumulations est corrélé avec l’initiation de la transcription et son côté explosive. Cependant, ces études sont pour la plupart faites sur des cellules, avec des accumulations de FTs crée artificiellement ou en utilisant des bases ADN artifiels comme lieu de fixation. Dans cette thèse, on utilise à notre avantage l’activation du génome chez l’embryo du poisson zèbre pour étudier comment la dynamique des accmulations de Nanog impact la transcription.
J’ai trouvé que Nanog fait de nombreuses accumulations dans le noyau, deux d’entre elles seulement colocalisant avec la transcription du groupe de gènes mir430. Les accumulations actives sont les plus volumineuses, brillante et plus intense comparées à toutes les autres dans le noyau. Les accumulations de Nanog régulant le locus mir430 se forme de deux manières : soit par croissance, soit par croissance combinée avec la fusion deux accumulations plus petites. J’ai observé que la transcription au locus mir430 commence quand l’accumulation de Nanog atteint un pic de fluorescence. Fait intéressant, les accumulations de Nanog atteignent toujours ce pic si la transcription est inhibée, mais forme un plateau, suggérant que les accumulations ne peuvent contenir qu’une quantité maximale de Nanog. La fusion des plus petites accumulations de Nanog était nécessaire pour avoir assez de Nanog, suggérant la présence d’un niveau minimal à atteindre pour commencer à transcrire. En utilisant le marquage du locus mir430 in vivo, j’ai trouvé que la fusion des accumulations de Nanog se forment toutes les deux sur le locus mir430 et que la fusion de ces accumulations était concomitante avec la compaction locale de l’ADN du locus mir430, avant qu’il ne commence à transcrire. Surtout, Nanog n’est pas nêcessaire pour la compaction du locus mir430 mais est important pour garder l’ADN ensemble une fois compacté.
Pour conclure, ce project de doctorat suggère que le niveau de Nanog au-dessus d’un niveau seuil à l’intérieur d’accumulations est important pour l’initiation de la transcription du locus mir430. La compaction locale de la chromatine au locus mir430 permet d’atteindre ces hauts niveaux de fluorescence par la fusion de plus petites accumulations. Ces données vont aider à préciser notre compréhension sur le role de la quantité de FTs en corrélation avec la transcription.