Cell polarization is an extremely important feature of potentially ail cell types and mis-regulation of this process can lead to catastrophic outcomes. While the ways of polarization can vary enormously depending on the cell shape and the physiological contexts, the core machinery that regulates this process has been conserved throughout évolution. At the centre of this machinery is the small Rho GTPase Cdc42.
Here I use fission yeast Schizosaccharomyces pombe as model organism to study Cdc42 régulation in this well polarized rod-shaped yeast. I focus my attention on the negative regulators of Cdc42 known as GAPs (GTPase activating proteins). At the beginning of my PhD, Rga4 was the only known Cdc42 GAP. I thus investigate how Rga4 localizes at the cell sides. I determine the requirements for Rga4 clustering and cortex binding with further attention to the residues responsible for cell side localization and tip exclusion.
In the course of my PhD a second Cdc42 GAP was identified: Rga6. Deletion of rga4 and rgaô was however unable to phenocopy a cdc42 hyperactive allele, indicating that other GAP(s) must exist. Moreover, previous analysis done in the lab had shown the presence of an Rga4 paralogue: Rga3.1 here demonstrate that rga3 deletion in combination with rga4 and rgaô deletions is able to mimic the phenotype of the cdc42 hyperactive allele and that Rga3 is indeed a novel Cdc42 GAP for Cdc42.
I focus on Rga3 localization pattern, as this is the only GAP that co-localizes with active Cdc42 at the cell tips, identifying the protein structural déterminants for its localization. I show that rga3, on its own, is dispensable for mitotic growth but plays an important rôle during the sexual cycle of the yeast. I show how rga3 is required for correct partner choice, as the polarization machinery is poorly able to assemble and disassemble in the early stages of mating as in wild type cells, and instead displays an alternative mechanism of polarity orientation. I also evidence the differential GAP requirement for active Cdc42 polarization during prolifération and sexual reproduction as deletion of the three GAPs leads to loss of polarization during vegetative growth but not during mating as the polarity machinery still shows assembly and disassembly of the polarity patch in early stages of the process.
Finally, I analyse the relation between Rga3 and Gapl, a negative regulator of Rasl that negatively regulates the mating process. I show the ability of Rga3 to promote polarity dynamics in gapl A cells and how these two proteins might regulate sexual reproduction at différent levels. I thus provide new insights into the régulation of the mating process by these negative regulators.
Régulation de Cdc42 par les protéines activatrices de la GTPase dans la
levure fïssipare
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Cell polarization is an extremely important feature that regards ail cell types. Neuronal cells, for example, are very polarized cells as it is required for them to transmit the signal from one cell to another. Whenever this process is not properly regulated cells' function can be dramatically impaired. Cancerous cells, as well as metastatic cells, are ofïten the resuit of loss of polarization, indicating the importance of the régulation of this process. Polarization in most eukaryotes relies on a small protein called Cdc42 and régulation of this protein is essential for cells to maintain their polarized state.
In this study I used Schizosaccharomycespombe, also known as fission yeast, as model organism. This yeast is rod-shaped and concentrâtes Cdc42 activity at the cell tips thus allowing polarized growth to occur only from the cell tips. When Cdc42 is not correctly regulated cells lose the rod shape and become rounded (small when downregulated and large when hyperactivated).
I analysed the regulators that negatively control the activity of Cdc42 in pombe. These proteins are known as GTPase activating proteins (GAPs) and I focused my attention in particular on one of the two already identified Cdc42 GAPs, Rga4, and showed the existence of a new GAP for Cdc42 in fission yeast called Rga3. Rga4 localizes at the sides of the cells while Rga3 co-localizes with active Cdc42 at the cell tips, I thus investigated the factors that determine their différent localization identifying the régions required for each protein localization.
I identified when Rga3 is required for Cdc42 régulation demonstrating that its main rôle is to regulate the yeast sexual reproductive process. This was assessed in the context of wild type cells but also when cells lack another known negative regulator of the sexual process. I thus provide new insights on Cdc42 régulation and how the mating process depends on this newly discovered Cdc42 regulator.
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La polarisation cellulaire est une caractéristique extrêmement importante pour tous les types de cellules et une perturbation de ce processus peut conduire à des résultats catastrophiques. Bien que les mécanismes de la polarisation puissent varier énormément selon la forme cellulaire et le contexte physiologique, la machinerie de base qui régule ce processus est resté conservé tout au long de l'évolution. Au centre de cette machinerie, on trouve la petite GTPase Rho Cdc42.
Dans cette étude, j'utilise Schizosaccharomycespombe, une levure polarisée en forme de bâtonnet, comme organisme modèle pour l'étude de la régulation de Cdc42. Je focalise ma recherche sur les régulateurs négatifs de Cdc42, connus sous le nom de GAPs (GTPase activating proteins). Au début de ma thèse, Rga4 était la seules Cdc42 GAP. J'étudie donc comme cette protéine se localise aux pôles de la cellule. En particulier, je détermine les conditions nécessaires pour le regroupement et la liaison au cortex de Rga4, avec une attention particulière aux résidus responsables de la localisation sur les côtés de la cellule et de l'exclusion des pôles cellulaires.
Au cours de mon doctorat, une deuxième Cdc42 GAP a été identifiée : Rga6. Néanmoins, la délétion simultanée de rga4 et rga6 était incapable de phénocopier un allèle cdc42 hyperactif, suggérant l'existence d'autre(s) GAP(s). De plus, des études précédentes au sein de notre laboratoire avait avaient mis en évidence l'existence d'un paralogue de Rga4 : Rga3. Je démontre ici que la délétion de rga3, en combinaison avec les délétions de rga4 et rgaô, est capable de mimer le phénotype d'un allèle cdc42 hyperactif et que Rga3 est en effet une nouvelle Cdc42 GAP de Cdc42.
Je me concentre sur le pattern de localisation de Rga3, car c'est la seule GAP qui est colocalisée avec la forme active de Cdc42 aux extrémités des cellules, en identifiant les protéines structurales responsables de sa localisation. Je démontre que rga3, en soi, est négligeable pour la croissance mitotique, mais par contre joue un rôle important durant le cycle sexuel de la levure. Je prouve que rga3 est nécessaire pour le bon choix du partenaire, car en présence d'une délétion de ce dernier, la machinerie de polarisation ne permet pas l'assemblage/désassemblage efficace dans les premiers stades de l'accouplement comme dans les cellules type sauvage, et présente plutôt un mécanisme alternatif d'orientation de la polarité.
Je mets également en évidence une implication différentielle de GAP entre la polarisation active de Cdc42 pendant la prolifération et la reproduction sexuée, car la suppression des trois GAPs entraîne une perte de polarisation pendant la croissance végétative, mais pas pendant l'accouplement, où la machinerie
de la polarité montre encore l'assemblage et le désassemblage du patch de polarité pendant les phases initiales de ce processus.
J'analyse enfin la relation entre Rga3 et Gapl, un régulateur négatif de Rasl, qui régule négativement le processus d'accouplement. J'analyse la capacité de Rga3 de promouvoir la dynamique de la polarité dans les cellules gapl A et comment ces deux protéines pourraient réguler la reproduction sexuée à différents niveaux. Mon travail apporte ainsi des nouvelles connaissances sur la régulation du processus d'accouplement par ces régulateurs négatifs.
Cdc42 régulation by GTPase activating proteins in fission yeast
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La polarisation des cellules est une caractéristique extrêmement importante pour tous les types de cellules. Les cellules neuronales, par exemple, sont des cellules très polarisées, car ceci est requis pour la transmission du signal d'une cellule à l'autre. Lorsque ce processus n'est pas correctement régulé, la fonction des cellules peut être considérablement perturbée. Les cellules cancéreuses, ainsi que les cellules métastatiques sont souvent le résultat de la perte de polarisation, indiquant l'importance de la régulation de ce processus. La polarisation chez la plupart des eucaryotes repose sur une petite protéine appeléé Cdc42 et sa régulation est essentielle pour la conservation de l'état polarisé des cellules.
Dans cette étude, j'ai utilisé Schizosaccharomycespombe, également connu sous le nom de «levure fïssipare», comme organisme modèle. Cette levure est en forme de bâtonnet et concentre l'activité de Cdc42 aux extrémités des cellules, ce qui permet une croissance polarisée uniquement à partir ces dernières. Lorsque Cdc42 n'est pas correctement régulée, les cellules perdent leur forme typique et deviennent arrondies (petites lors d'une diminution de l'activité et grandes lors d'une hyperactivité).
J'ai analysé les régulateurs qui contrôlent négativement l'activité de Cdc42 dans la levure. Ces protéines sont connues sous le nom de GAPs («GTPase activating protéins»). J'ai étudié en détail une des deux Cdc42 GAP protéines connues, Rga4, et montré l'existence d'une nouvelle GAP appelée Rga3. Rga4 est localisée sur les côtés des cellules tandis que Rga3 co-localise avec la protéine Cdc42 active aux extrémités. J'ai donc étudié les facteurs qui déterminent cette localisation différentielle en identifiant les domaines requis pour leur localisation spécifique.
J'ai identifié le rôle principal de Rga3 dans la régulation de Cdc42, en démontrant l'importance de son activité dans le processus de la reproduction sexuelle de la levure. Ceci a été évalué chez les cellules de type sauvage et également lorsqu'un autre régulateur négatif connu du processus sexuel est inactivé. Mon travail apporte donc des nouvelles connaissances sur la régulation de la protéine Cdc42 et sur la façon dont le processus d'accouplement de la levure dépend de ce régulateur récemment découvert.