Ewing sarcoma is the second most common form of pediatric bone cancer and is characterized by chromosomal translocations involving sequences that encode the N-terminal part of EWSR1 and the C-terminal part of FLI1. The oncogenic EWS-FLI1 fusion protein operates as a pioneer factor to induce chromatin features typical of active enhancers at GGAA microsatellite repeat elements. Importantly, the ability to bind and activate GGAA repeats is a neomorphic property of EWS-FLI1 that requires the phase transition properties of EWSR1 and leads to the recruitment of critical chromatin regulators. Despite the significance of EWS-FLI1 bound GGAA microsatellite repeat elements in the chromatin landscape of Ewing sarcoma, their contribution to oncogenic gene regulation programs has not been directly assessed. We thus sought to use epigenome editing tools to directly test the function of EWS-FLI1 GGAA repeats in Ewing sarcoma. We first used nascent transcription profiling by NRO-seq to demonstrate that a subset of EWS-FLI1 bound GGAA microsatellites are transcriptionally active and exhibit enhancer RNAs (eRNAs) that are typical of functional enhancer elements. We next used CRISPR dCas9-KRAB to silence selected GGAA repeats by targeting immediately adjacent unique sequences. These experiments led to a drastic repression of active marks in local chromatin states and marked decreases in eRNA as well as in putative target gene expression. Moreover, targeting a unique GGAA repeat enhancer regulating SOX2 transcription from a distance of 470kb led to significant decreases in SOX2 expression and xenograft tumor growth in vivo.
Our studies show that GGAA repeats are critical regulatory elements that make major contributions to gene expression, tumor growth and survival. More broadly, these results also suggest that microsatellite repeats may play important roles as regulatory elements in normal physiology and disease. The epigenome editing approaches used our studies may thus be adapted for studying repetitive elements in a variety of biological settings, testing their functional significance and measuring their potential value for the development of new therapies.
--
Le sarcome de Ewing est le deuxième cancer pédiatrique le plus fréquent. Il est caractérisé par une translocation combinant la partie N-terminale d’EWSR1 et la partie C- terminale de FLI1. Dans cette maladie, la protéine de fusion oncogénique EWS-FLI1 acquiert la capacité de reconnaître et de lier l’ADN au niveau de séquences microsatellites contenant une répétition du motif GGAA où elle induit un remodelage de la chromatine conduisant à la formation de régions activatrices pour les gènes environnants. Cette activité requiert les propriétés uniques de transition de phase d’EWSR1 qui permettent de concentrer à ces séquences répétitives d’importants régulateurs de la chromatine. Malgré l’importance présumée de ces régions activatrices, leur exacte contribution n’a pas encore été élucidée.
Nous avons d’abord mis en évidence la transcription d’eRNAs par NRO-seq au niveau de séquences microsatellites activées par EWS-FLI1, un marqueur associé à l’activité fonctionnelle de régions distales. Nous avons ensuite inactivé des régions microsatellites moyennant l’utilisation du système CRISPR dCas9-KRAB et d’un sgRNA ciblant une séquence directement adjacente. Ces expériences ont montré une répression localisée des marques d’activité de la chromatine, une diminution de la transcription d’eRNAs et, de manière importante, une diminution spécifique de l’expression des gènes environnants sous contrôle de ces régions activées uniquement dans le sarcome de Ewing. Notamment, la diminution de l’expression de SOX2 au moyen de l’inhibition d’une région microsatellite située à 470 kb de son promoteur provoque une diminution significative de la croissance tumorale in vivo. Ainsi, notre étude a permis de démontrer que l’activation de séquences microsatellites dans le sarcome de Ewing met en place un important réseau oncogénique favorisant la survie tumorale. De manière plus générale, nous avons présenté une technique accessible et efficace qui permet l’étude de séquences répétitives dans le génome de différents systèmes et qui permet également de tester le potentiel de nouveaux moyens thérapeutiques.