Sessile land plants cannot escape to noxious heat shock (HS) occurring usually at midday until late in the afternoon during heat waves events. To survive, they need to perceive mild temperature variations in order to prime molecular defenses. Among them, heat shock proteins (HSPs), whose expression is strongly repressed at a low temperature, become overexpressed during HS. HSPs can reduce damages such as misfolding, protein aggregation and participate in the stabilization of membranes leading to the acquired thermotolerance (AT) in plants. In the plasma membrane, cells express cyclic nucleotide- gated channels (CNGC) that act as thermosensors and drive a conditional entry of external Ca2+ within the cytosol. This results in an unclear signal that activates heat shock transcription factor 1 and causes the accumulation of HSPs. In the context of global warming, it is important to clarify which are all the heat sensors and the signaling pathways ultimately triggering the proper expression of protective HSPs for the onset of AT.
The aim of this thesis was to search for components involved in the repression at low temperatures and the activation at high temperatures of the accumulation of HSPs in the model plant A. thaliana. A new transgenic line called HIBAT was generated as a reporter to analyze the heat shock response (HSR) in vivo. It contains a fusion protein made of a bioluminescent nano-luciferase and a conditionally toxic negative marker, called D-amino acid oxidase. This chimeric protein was strictly under the control of a heat- inducible promoter from small HSPs. The reporter line served in a forward genetic screen in an attempt to identify genes whose mutations would render plants defective in their ability to sense and/or to transduce HS signals. Under HS, seven isolated candidates were apparently unable to accumulate the fusion protein leading to be resistant in the presence of D-valine, did not produce light, and ultimately showed a reduced HSPs accumulation. Some of them were not respecting an expected segregation at the M3 and F2 generation but were submitted to the whole genome sequencing. Yet, too many single nucleotide polymorphisms (SNPs) were found which did not allow to clearly identify genes responsible for heat sensing and signaling. Moreover, most offspring candidates were able to accumulate the same amount of the fusion reporter and HSPs compared to the parental line under HS. 24-fold more non-mutagenized HIBAT lines were found to survive at several iterative HS and in the presence of D-valine compared to plants growing with the additional inhibitor of DNA methylation, called zebularine. Few survivors were found to recover the expression of the fusion protein and HSPs following a single HS treatment, 2 weeks later the end of HS cycles. This result indicated that the loss of heat sensing has resulted from reversible epigenetic DNA methylation. Additionally, we found a strong indication that plants might be able to establish such a program under iterative HS which would have transiently and being reversible the expression of one, if not all, heat-induced proteins which might become deleterious when excessively expressed.
The fifth chapter aims to screen mutants whose mutations affected the repressory machinery preventing the expression of HSPs at non-HS temperature by using the mutagenized HIBAT line but in the absence of D-valine and HS. One mutant was isolated that produced a higher amount of bioluminescence and HSPs at low (22°C) and mild (31°C) temperatures. The plant candidate was sequenced and a list of 232 putatively SNPs involved in the repression of HSPs remains to further refine by sequencing the F2 mutant to reduce the genetic background which is not related to the phenotype.
The sixth chapter addresses the role of calmodulin (CaM) 1 and CaM 5 in the HS signaling. Both CaMs were found to strongly interact specifically with the CNGC2 cytosolic domain in a yeast two-hybrid screen, suggesting they are involved in the heat shock signaling pathway. A double cam1/cam5 mutant was generated by crossing T-DNA insertions lines and by using the CRISPR technology in A. thaliana. Their role in the HSR remains to be analyzed in the mutants which are expected to be defective to accumulate HSPs under HS.
The seventh chapter emphasizes the fact that a specific class of small HSPs is strongly repressed at low temperatures, and the HSR is not only involved in their accumulation but also in their derepression. This suggests that if small HSPs were unnecessary express at non-HS temperature, it would cause a deleterious effect in plants. Therefore, this question was addressed by designing an A. thaliana transgenic line in which the small HSP17.6a, normally strongly repressed at low temperature, can be conditionally accumulated under the control of a chemical. This line was generated but remains to be analyzed with regards to its ability to overproduced small HSPs at low temperatures and to address the expected deleterious effect.
In the context of global warming, this research aimed to be better elucidate how plants sense the temperature on time to accumulate appropriate molecular defenses leading to an otherwise deadly HS. Understanding this aspect is the first step to what is controlling this phenomenon opening the possibility to eventually prepare crops plant to better respond to extreme temperatures in the future.
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Les plantes terrestres sessiles ne peuvent pas échapper à un choc thermique nocif (CT) qui se produit généralement à midi jusqu'à tard dans l'après-midi pendant des vagues de chaleur. Pour survivre, elles doivent être capables de percevoir les augmentations de température afin d'amorcer des défenses moléculaires appropriées. Parmi elles, les protéines de choc thermique (HSPs), dont l'expression est fortement réprimée à basse température, deviennent surexprimées au cours du CT. Elles peuvent réduire les dommages tels que le mauvais repliement, l'agrégation des protéines et participer à la stabilisation des membranes ce qui conduit les plantes à acquérir la thermotolérance. Dans la membrane plasmique, les cellules végétales contiennent des capteurs de chaleur appelés canaux cycliques nucléotidiques (CNGCs). Elles permettent une entrée d’ions Ca2+ dans le cytosol pendant un CT. Il en résulte un signal inconnu qui active néanmoins les facteurs de transcription HSFA1 ce qui déclenche l’accumulation de HSPs. Dans un contexte de réchauffement climatique, il reste à élucider tous les mécanismes de perception et de signalisation de la chaleur conduisant à accumuler les HSPs chez les plantes.
Le but de cette thèse visait à trouver de nouveaux partenaires impliqués dans la répression à basse et l’activation à haute température des HSPs dans la plante modèle A. thaliana. Une nouvelle lignée transgénique appelée HIBAT a été générée, en tant que rapporteur, afin d’analyser in vivo la réponse au choc thermique (RCT). Elle contient une protéine de fusion composée d’une nano-luciférase bioluminescente et d’un marqueur négatif conditionnellement toxique appelé D-amino acide oxydase. Cette protéine chimérique est strictement sous le contrôle d'un promoteur inductible par la chaleur provenant d’une petite HSP. La lignée HIBAT a servi dans un criblage génétique direct pour identifier les gènes dont les mutations rendraient les plantes défectueuses à détecter et/ou à transduire des signaux de CT. Après un CT, sept candidats isolés étaient apparemment incapables d'accumuler la protéine de fusion conduisant à être résistante en présence de D-valine, n'ont pas produit de lumière et ont finalement montré une accumulation réduite de HSPs. Certains d'entre eux ne suivaient la ségrégation attendue aux générations M3 et F2 mais ont été néanmoins soumis à l'ensemble du séquençage du génome. Pourtant, beaucoup de polymorphismes mono-nucléotidiques (PMN) ont été trouvés, ce qui n'a pas permis d'identifier les gènes responsables de la détection et de la signalisation de la chaleur. De plus, la plupart des descendants venant des candidats isolés, étaient capables d'accumuler la même quantité de protéine de fusion et des HSPs par rapport à la lignée parentale sous CT. Il a été trouvé 24 fois plus de plantes HIBAT non mutagénisées survivants à plusieurs CT itératives et en présence de D-valine, par rapport aux plantes cultivées avec un inhibiteur de la méthylation de l'ADN, appelé zébularine. De plus, deux semaines après la fin des cycles CT, peu de survivants étaient capables d’exprimer la protéine de fusion et les HSPs après un seul CT. Ce résultat indiquait que la perte de détection de la chaleur résultait des méthylations réversibles sur l'ADN induit par un programme épigénétique établit par les plantes sous CT itérative. Ce programme pourrait donc réprimer de manière transitoire et réversible l'expression d'une, sinon toutes, des HSPs ce qui pourrait indiquer aussi que leur surexpression pourrait être délétère pour les plantes.
Le cinquième chapitre se focalise sur l’isolation de mutants dont les mutations affectaient le mécanisme de répression impliqué dans l’expression des HSPs à basse température en utilisant la lignée HIBAT mais en l’absence de D-valine et de CT. Un mutant a été isolé qui produisait à la fois une bioluminescence et des HSPs plus élevés à des températures basses (22°C) et moyennes (31°C). Il a été séquencé et en a résulté une liste de 232 PMN. Il reste à affiner davantage cette liste en séquençant le mutant à la génération F2 afin de réduire le bruit génétique n'étant pas lié au phénotype.
Le sixième chapitre aborde le rôle de la calmoduline (CaM) 1 et CaM 5 dans la signalisation du CT. Les deux CaMs se sont révélées à interagir spécifiquement avec le domaine cytosolique CNGC2 dans une expérience à deux hybrides de levure, ce qui suggère qu'elles sont impliquées dans la voie de signalisation du CT. Un double mutant cam1/cam5 a été généré en croisant des lignées d'insertion d'ADN-T et un utilisant la technologie CRISPR chez A. thaliana. Leur rôle dans la RCT doit être analysé chez les mutants où l'on s'attend à ce qu'ils soient défectueux pour accumuler des HSPs sous CT.
Le septième chapitre souligne le fait qu'une classe spécifique des petits HSPs est fortement réprimée à basse température, et la RCT n'est pas seulement impliqué dans leur accumulation mais aussi dans leur dérépression. Cela suggère que si elles étaient exprimées à une température basse cela provoquerait un effet délétère chez les plantes. Par conséquent, nous avons abordé cette question en concevant une lignée transgénique
A. thaliana dans laquelle HSP17.6a, normalement fortement réprimé à basse température, peut être accumulé de manière conditionnelle sous le contrôle d'un produit chimique.
Cette lignée a été générée mais elle reste à être analysée dans sa capacité à surproduire la HSP17.6a à basse température et en s’attendant à un effet délétère.
Dans un contexte de réchauffement climatique, mes recherches visaient à mieux comprendre comment les plantes ressentent la chaleur à temps en accumulant des défenses moléculaires appropriées pour empêcher un CT mortel. Comprendre cet aspect est la première étape pour contrôler ce phénomène, ouvrant la possibilité de préparer les plantes cultivées afin qu'elles répondent aux futures températures extrêmes.