Pseudouridine (Ψ) is the most abundant RNA modification and is present in various RNA species including tRNAs, snRNAs, snoRNAs, rRNAs, lncRNAs and more recently in mRNAs. It is synthesized by pseudouridine synthases and is required to stabilize the RNA structure. Patients carrying mutations in different PUS enzymes have been identified in the last decades. In this study, we generated three fly models of diseases caused by mutations in Pus enzymes linked to neurological phenotypes to gain insights into the molecular mechanism of PUS diseases. First, we recently reported about patients harboring deleterious mutations in the pseudouridine synthase 7 (PUS7) gene, featuring intellectual disability, microcephaly, increased aggression levels and hyperactivity. To gain insight into the underlying mechanisms, we generated a Drosophila model carrying loss of function mutations in the Pus7 fly homolog. The mutants are viable but display behavioral defects including altered orientation, aggressiveness and hyperactivity. We show that the Pus7 mutation leads to the loss of Ψ at position 13 in several tRNAs, which is associated with reduced level of tRNAAsp and increased ribosome occupancy at Asp codons. Furthermore, multiple metabolic pathways including glycolysis, the leloir pathway, TCA cycle and beta oxidation are dysregulated. Mass-spec analysis of the proteome and metabolome revealed a glycolytic shift in Pus7fs mutant flies towards increased levels of glycolysis and reduced TCA cycle activity concomitant with reduced mitochondrial respiration. Overexpression of tRNAAsp completely rescues the mitochondrial dysfunction as well as the aggressive behavior highlighting its importance in the mechanism of disease. Moreover, inhibition of glycolysis is sufficient to rescue the defects in aggression suggesting a causal link between aggression and hyperglycemia. Second, our collaborators have identified patients with mutations in PUSL1 suffering from microcephaly and developmental delay. Hence, we generated flies mutant for Drosophila PusL1 which feature reduced lifespan on paraquat indicating a conserved mitochondrial role of PusL1, while mitochondrial respiration is not affected matching the observations made in human patients. Additionally, phenotypic characterizations revealed indications of hyperactivity suggesting neurological defects which require further confirmation. Third, patients with mutations in PUS3 were described to feature microcephaly, developmental delay, intellectual disability and seizures. Thus, we generated flies mutant for the Drosophila Pus3 homolog. Mapping of Ψ sites confirmed that these flies lack pseudouridine at position 38 and 39 in several tRNAs. Furthermore, survival assays revealed increased lifespan on normal food and during complete starvation while lifespan was reduced in response to amino acid starvation. Moreover, this was corroborated by reduced levels of Drosophila insulin like peptides indicating a role of Pus3 in metabolic stress response. Also, Pus3 mutant flies showed reduced activity and developmental delay, however, seizures could not be reproduced in the Pus3 fly model. Summed up, we could demonstrate that Drosophila constitutes a suitable model to investigate neurological defects observed in human PUS diseases and provide a basis for future research of their pathomechanism. Together, our data provide new insight into the molecular defects associated with the loss of pus enzymes in flies and suggest potential new avenues for therapeutic treatment.
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La pseudouridine (Ψ) est la modification la plus abondante de l’ARN et est présente dans diverses espèces d’ARN, y compris les ARNt, les ARNs, les ARNsn, les ARNr, les ARNsnc et, plus récemment, les ARNm. Elle est synthétisée par les pseudouridines synthases et est nécessaire pour stabiliser la structure de l’ARN. Des patients porteurs de mutations dans différentes enzymes PUS ont été identifiés au cours des dernières décennies. Dans cette étude, nous avons généré trois modèles de mouches de maladies causées par des mutations dans les enzymes Pus liées à des phénotypes neurologiques afin de mieux comprendre le mécanisme moléculaire des maladies PUS. Tout d’abord, nous avons récemment fait état de patients porteurs de mutations délétères dans le gène de la pseudouridine synthase 7 (PUS7), présentant une déficience intellectuelle, une microcéphalie, une augmentation de l’agressivité et de l’hyperactivité. Afin de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents, nous avons mécanismes sous-jacents, nous avons généré un modèle de drosophile porteur de mutations dans l’homologue de la mouche Pus7. Les mutants sont viables mais présentent des défauts de comportement, notamment une orientation altérée, de l’agressivité et de l’hyperactivité. Nous montrons que la mutation de Pus7 entraîne la perte de Ψ en position 13 dans plusieurs ARNt, ce qui est associé à un niveau réduit d’ARNtAsp et à une augmentation de l’occupation du ribosome au niveau de l’As et une augmentation de l’occupation des ribosomes au niveau des codons Asp. En outre, plusieurs voies métaboliques, dont la la glycolyse, la voie de Leloir, le cycle TCA et la bêta-oxydation sont dérégulées. L’analyse de masse du protéome et du métabolome a révélé un changement glycolytique chez les mouches mutantes Pus7fs vers des niveaux accrus de glycolyse et une activité réduite du cycle TCA concomitante à une respiration mitochondriale réduite. La surexpression de tRNAAsp résout complètement le dysfonctionnement mitochondrial ainsi que le comportement agressif, soulignant son importance dans le mécanisme de la maladie. De plus, l’inhibition de la glycolyse est suffisante pour sauver les défauts d’agressivité, ce qui suggère un lien de causalité entre l’agressivité et l’hyperglycémie. Deuxièmement, nos collaborateurs ont identifié des patients présentant des mutations dans PUSL1 et souffrant de microcéphalie et de retard de développement. Nous avons donc généré des mouches mutantes pour PusL1 de drosophile qui présentent une durée de vie réduite sous paraquat, indiquant un rôle mitochondrial conservé de PusL1, alors que la respiration mitochondriale n’est pas affectée, ce qui correspond aux observations faites chez les patients humains. En outre, les caractérisations phénotypiques ont révélé des signes d’hyperactivité suggérant des défauts neurologiques qui doivent être confirmés. Enfin, des patients présentant des mutations dans PUS3 ont été décrits comme présentant une microcéphalie, un retard de développement, une déficience intellectuelle et des crises d’épilepsie. Nous avons donc généré des mouches mutantes pour l’homologue Pus3 de drosphile. La cartographie des sites Ψ a confirmé que ces mouches manquent de pseudouridine en position 38 et 39 dans plusieurs ARNt. En outre, des tests de survie ont révélé une augmentation de la durée de vie avec de la nourriture normale et pendant une famine complète, tandis que la durée de vie était réduite en réponse à une famine d’acides aminés en réponse à la privation d’acides aminés. En outre, ces résultats ont été corroborés par des niveaux réduits de peptides analogues à l’insuline de la drosophile indiquant un rôle de Pus3 dans la réponse au stress métabolique. En outre, les mouches mutantes Pus3 ont montré une activité réduite et un retard de développement, mais les crises d’épilepsie n’ont pas pu être reproduites dans le modèle de la mouche Pus3. En résumé, nous avons pu démontrer que la drosophile constitue un modèle approprié pour étudier les défauts neurologiques observés dans les maladies humaines PUS et fournir une base pour la recherche future sur leur pathomécanisme. L’ensemble de nos données donne un nouvel aperçu des défauts moléculaires associés à la perte des enzymes pus et suggèrent de nouvelles voies potentielles pour le traitement thérapeutique.