Les virus pathogènes émergents sont responsables de maladies parmi les plus sévères et représentent un problème majeur de santé publique. Les arénavirus et les hantavirus sont des virus enveloppés possédant un génome à ARN monocaténaire négatif et sont considérés comme des agents pathogènes d'importance prioritaire par les Centres pour le contrôle et la prévention des maladies (Centers of Disease Control and Prévention). Il n'y a pas de vaccin homologué contre ces virus et nos options thérapeutiques se limitent actuellement aux soins de soutien et à l'utilisation non indiquée de la ribavirine, entraînant des taux de létalité très élevés. La mise au point de médicaments antiviraux et de vaccins protecteurs efficaces contre ces virus est donc hautement prioritaire. L'attachement et l'entrée du virus représentent des étapes cruciales de l'infection de la cellule hôte et constituent des cibles thérapeutiques prometteuses. Par conséquent, dans cette thèse, nous avons étudié les facteurs cellulaires exploités par les virus pour pénétrer dans les cellules hôtes et nous les avons évalués comme cibles potentielles pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre ces agents pathogènes.
Dans le projet 1, nous avons étudié le mécanisme d'entrée de l'arenavirus de l'Ancien Monde Lassa (LASV). Nous avons utilisé le virus de la chorioméningite lymphocytaire recombinante (LCMV) exprimant la glycoprotéine de LASV (rLCMV-LASVGP) comme substitut du niveau de biosécurité (BSL) 2 pour montrer que le LASV pénètre dans les cellules épithéliales humaines via son récepteur dystroglycan (DG) à haute affinité en utilisant une voie associée à la macrôpinocytose. En examinant les inhibiteurs de kinases, nous avons identifié l'inhibiteur de HGFR EMD 1214063 ayant des propriétés prometteuses en tant que médicament antiviral contre le rLCMV-LASVGP. Ensuite, nous avons caractérisé le rôle exact de la kinase TAM Axl dans l'entrée de LASV. Nous avons constaté qu'en absence de dystroglycan fonctionnel, rLCMV- LASVGP peut utiliser Axl comme récepteur d'entrée. Dans les cellules endothéliales qui expriment un faible niveau de DG fonctionnel, les deux récepteurs peuvent favoriser l'entrée du LASV. Ces résultats justifient le ciblage d'Axl dans le traitement antiviral.
Dans le projet 2, nous avons identifié le dérivé du clotrimazole TRAM-34, un inhibiteur spécifique du canal KCa3.1, en tant que composé antiviral. Nous avons utilisé des pseudotypes VSV portant la glycoprotéine des aréna, des bunya- et des filovirus et nous avons constaté que TRAM-34 bloquait sélectivement les arénavirus. Nous avons également démontré que l'effet antiviral était indépendant de sa cible pharmacologique KCa3.1. Enfin, nous avons montré que TRAM-34 n'affectait ni la liaison ni l'endocytose du récepteur viral, mais bloquait spécifiquement la fusion des arénavirus. Ces résultats ont révélé un mécanisme d'action antivirale nouveau des clotrimazoles, ouvrant la possibilité de réutiliser ces médicaments pour une intervention thérapeutique.
Dans le projet 3, nous avons caractérisé la voie d'entrée utilisée par les hantavirus pour pénétrer dans les cellules des voies respiratoires épithéliales humaines. L'évaluation des inhibiteurs de kinases dans un test de criblage basé sur les pseudotypes du virus Hantaan (HTNV) et du virus Andes (ANDV) a montré un premier lien entre l'entrée des virus hanta et la macropinocytose. Nous avons ensuite testé une sélection d'inhibiteurs «diagnostiques» ciblant les facteurs cellulaires impliqués dans la macropinocytose et nous avons fourni les premières preuves du rôle de cette voie endocytaire dans l'entrée des hantavirus, avec d'importantes différences spécifiques au virus. L'entrée des VSV-HTNVGP et VSV-ANDVGP dépendait de façon critique des échangeurs sodium-proton (NHE) et de l'actine, qui sont les principales caractéristiques de la macropinocytose. Cependant, les pseudotypes HTNV et ANDV ont également montré une dépendance différentielle vis-à-vis des facteurs régulateurs connus de cette voie. Enfin, dans le laboratoire BLS 3, nous avons montré que EIPA, l'inhibiteur dés NHE, bloque l'HTNV authentique au même titre que le virus de substitution, ce qui en fait un composé antiviral potentiel.
Pris ensemble, ces résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes contrôlant l'entrée dans les cellules hôtes d'importants agents pathogènes émergents, ouvrant la voie à l'identification et au développement de nouveaux traitements antiviraux.
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Emerging human pathogenic viruses are responsible for some of the most severe diseases and represent a major public health concern. Arenaviruses and hantaviruses are enveloped viruses with negative single- stranded RNA genomes and are considered by the Centers of Disease Control and Prévention as category A and C priority pathogens, respectively. There are no licensed vaccines against these viruses and our therapeutic options are currently limited to supportive care and off-label use of ribavirin, resulting in very high case-fatality rates. The development of efficacious antiviral drugs and protective vaccines against these viruses is therefore of high priority. Virus attachment and entry represent crucial steps of host cell infection and represent therefore promising drug targets. Therefore, in this thesis we have studied cellular factors exploited by viruses to enter host cells and evaluated them as target for the development of new stratégies to fight against those pathogens.
In project 1, we investigated the mechanism of entry of the Old World arenavirus Lassa virus (LASV). We used recombinant lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) expressing LASV glycoprotein (rLCMV-LASVGP) as a biosafety level (BSL) 2 surrogate to show that LASV enters human epithelial cells via its high affînity receptor dystroglycan (DG) using a macropinocytosis-related pathway. We found that rLCMV-LASVGP hijacks an endocytic route that only partially resembles classical macropinocytosis. By screening of kinase inhibitors, we identified the hepatocyte growth factor receptor (HGFR) inhibitor EMD 1214063 as new antiviral drug candidate against LASV. Next, we characterized the exact rôle of the TAM kinase Axl in LASV entry. We found that in absence of functional dystroglycan, rLCMV-LASVGP is able to use Axl as entry receptor. In endothelial cells that express low level of functional DG, both receptors can promote LASV entiy. These results provide a rationale for targeting Axl in antiviral therapy.
In project 2, we identify the clotrimazole-derivate TRAM-34, a specific inhibitor of the KCa3.1 channel, as antiviral compound. We employed a panel of VSV pseudotypes bearing the glycoprotein of arena-, bunya- and filoviruses and found that TRAM-34 blocks selectively cell entry of arenaviruses. We also demonstrate that the antiviral effect is independent of its pharmacological target KCa3.1. Finally, we showed that TRAM-34 neither affected virus-receptor binding nor endocytosis but specifically blocked arenavirus fusion. These results revealed a novel and unexpected mechanism of antiviral action of clotrimazoles, opening the possibility to repurpose these drugs for antiviral therapeutic intervention.
In project 3, we wanted to better characterize the largely unknown entry pathway used by hantaviruses to enter human epithelial airway cells. Screening of kinase inhibitors in a semi high-throughput assay based on Hantaan virus (HTNV) and Andes virus (ANDV) pseudotypes suggest macropinocytosis as possible entry pathway. We next tested a well-defïned panel of "diagnostic" inhibitors targeting cellular factors implicated in macropinocytosis and provided first evidence for a rôle of this endocytic route in
hantaviruses cell entry with important virus-specific différences. Entry of both, VSV-HTNVGP and VSV-
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ANDVGP critically depended on sodium-proton exchangers (NHE) and actin, which are major hallmarks of macropinocytosis. However, HTNV and ANDV pseudotypes further displayed differential dependence on known regulatory factors of this pathway. Finally, in BLS 3 laboratory we showed that the authentic HTNV is blocked by EIPA, the NHE inhibitor, in the same way as the surrogate viruses making this inhibitor a potential antiviral compound.
Taken together these results allow a better understanding of mechanism governing entry in host cells of important emerging pathogens pawing the avenue for the identification and development of novel antiviral therapeutics.