The cell-killing mechanism of TAT-RasGAP317-326 and the endosomal escape capacity of cell-penetrating peptides

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Serval ID
serval:BIB_802F9F62AA62
Type
PhD thesis: a PhD thesis.
Collection
Publications
Institution
Title
The cell-killing mechanism of TAT-RasGAP317-326 and the endosomal escape capacity of cell-penetrating peptides
Author(s)
Serulla Llorens Marc
Director(s)
Widmann Christian
Institution details
Université de Lausanne, Faculté de biologie et médecine
Publication state
Accepted
Issued date
11/02/2022
Language
english
Abstract
Cell-penetrating peptides (CPPs) are short (<30 amino acids), generally cationic, peptides that deliver cargos, that normally would not cross the plasma membrane, into cells and, thus, they are very interesting in research and clinics. CPPs access the cytosol either by direct translocation through the plasma membrane or via endocytosis followed by endosomal escape. Both direct translocation and endosomal escape can occur simultaneously leading to confusion and debate in which entry route CPPs take. We propose a methodological approach based in plasma membrane depolarization that blocks CPP direct translocation, but allows CPP uptake into endosomes in order to freely evaluate endosomal escape. Despite good endocytic uptake many CPPs previously considered to access the cytosol via endosomal escape, failed to access the cytosol once direct translocation was abrogated. Even CPPs designed for enhanced endosomal escape actually showed negligible endosomal escape into the cytosol. Our data reveal that cytosolic localization of CPPs occurs mainly by direct translocation across the plasma membrane. Therefore, cell depolarization represents a simple manipulation to stringently test the endosomal escape capacity of CPPs.
In addition to that, we have characterized the cell death mechanism of an anticancer and antimicrobial CPP bearing peptide, called TAT-RasGAP317–326. Here we found that TAT-RasGAP317–326, after crossing the plasma membrane via direct translocation, binds lipids present at the inner-leaflet of the plasma membrane (PIP2 and PS) and from that position disrupts the cell membrane leading to a necrotic cell death. Moreover, we described that, the W317A TAT-RasGAP317–326 point mutant, known to have impaired killing activities, has reduced abilities to bind and permeabilize PIP2- and PS-containing membranes and to translocate through biomembranes, presumably because of a higher propensity to adopt an α-helical state. To sum up, TAT- RasGAP317-326 kills cancer cells in a manner that does not involve known genetically programmed cell death pathways. This is extremely useful for cancer therapy, since strategies that trigger non-genetically encoded forms of cell death would provide additional therapeutic options to fight cancer in a chemo- and radio- therapy relapse scenario.
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Les peptides pénétrant les cellules (CPP pour «cell-penetrating peptide» en anglais) sont de courts peptides (<30 acides aminés), généralement cationiques. Ils peuvent être couplés à des molécules ou substances, qui normalement ne traverseraient pas la membrane plasmique, et les transporter à l’intérieur de la cellule. Cette propriété rend les CPP très intéressants en recherche et en clinique. Les CPP accèdent au cytosol de la cellule soit par translocation directe à travers la membrane plasmique, soit par endocytose suivie d’un échappement endosomal («endosomal escape» en anglais). La translocation directe et l’échappement endosomal peuvent se produire simultanément, ce qui complique l’étude de l’accès cytosolique des CPP et alimente le débat sur les voies d'entrée empruntées par les CPP. Dans cette thèse, j’ai utilisé une approche méthodologique basée sur la dépolarisation de la membrane plasmique qui bloque la translocation directe des CPP, mais pas leur endocytose, afin d’étudier spécifiquement le processus de l’échappement endosomal. Mes résultats montrent que, malgré une bonne absorption endocytaire, les CPP que j’ai testé, inclus des CPP conçus pour sortir efficacement des endosomes, ne se sont pas retrouvés dans le cytosol une fois la translocation directe abrogée. Mes données révèlent donc que la présence de CPP dans le cytosol est le résultat de la translocation directe à travers la membrane plasmique. La dépolarisation cellulaire représente une manipulation simple pour tester rigoureusement la capacité d'échappement endosomal des CPP.
J’ai également caractérisé la manière dont TAT-RasGAP317-326, un CPP ayant des propriétés anticancéreuses et antimicrobiennes, est capable d’induire la mort de cellules cancéreuses. Les données que j’ai obtenues montrent que TAT-RasGAP317- 326, après avoir traversé la membrane plasmique via une translocation directe, se lie aux lipides présents au niveau du feuillet interne de la membrane plasmique (PIP2 et PS). Cette liaison compromet l’intégrité de la membrane cellulaire, entrainant une mort cellulaire nécrotique. J’ai également montré que le mutant W317A de TAT-RasGAP317- 326, qui n’est pas capable de tuer les cellules cancéreuses, a des capacités réduites à se lier et à perméabiliser les membranes contenant PIP2 et PS. Ce mutant a également une capacité limitée à se déplacer à travers les membranes cellulaires, probablement en raison d'une plus grande propension à adopter un état α-hélicoïdal. En résumé, TAT-RasGAP317-326 tue les cellules cancéreuses d'une manière qui n'implique pas les
voies de mort cellulaire génétiquement programmées connues. Ceci est extrêmement utile pour le traitement du cancer, car les stratégies qui déclenchent des formes de mort cellulaire non codées génétiquement fourniraient des options thérapeutiques supplémentaires pour lutter contre le cancer dans un scénario de rechute suivant des chimiothérapies ou la radiothérapie.
Create date
24/03/2022 16:52
Last modification date
22/06/2022 5:38
Usage data