Le facteur cellulaire hôte (Host Cell Factor 1, HCF-1, en anglais) humain, codé par le gène HCFC1 lié au chromosome X, est un composant important d'un grand nombre de complexes régulateurs transcriptionnels impliqués à la fois dans l'activation et la répression de l'expression génique. Cette régulation dépend en grande partie des interactions avec les protéines de liaison à l'ADN et les protéines modificatrices de chromatine par l'intermédiaire d'un domaine N-terminal conservé appelé domaine Kelch. Avec cette plasticité, il joue un rôle à la fois dans la régulation de la prolifération cellulaire et du métabolisme.
Des résultats récents ont souligné l'importance de HCF-1 pour la santé ou le bien-être humain : des mutations dans la séquence codante de son gène sont associées au phénotype du trouble cobalaminique cblXet à la déficience intellectuelle non syndromique (NS-ID).
Les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la formation du complexe HCF-1 restent flous, de même que le rôle exact de HCF-1 dans le métabolisme de la cobalamine. Ma thèse exploite l'information recueillie à partir de la génétique de HCFC1 humain pour comprendre les interactions et les rôles de HCF-1 dans les cellules humaines.
Pour atteindre cet objectif, j'ai créé sept lignées cellulaires mutantes HEK-293 qui portent une seule mutation HCFC1 grâce à la technologie CRISPR-Cas9. Les mutations sélectionnées sont toutes dans le domaine Kelch de HCF-1. Cinq de ces mutations sont associées à la pathologie chez l'homme et se répartissent en deux groupes : (i) cbl-X : Q68E, A73V, Al 15V et Y103H et (ii) NS- ID : S225N. De plus, une mutation historique de HCFC1 sensible à la température, générée par la sélection génétique de cellules rénales de bébé hamster mutées chimiquement, appelées P134S, ainsi qu'une mutation NS-ID mal annotée (T239M) ont été incluses dans l'étude.
J'ai analysé à la fois les phénotypes (prolifération cellulaire, morphologie et métabolisme des mitochondries) et la "-omique" (génomique, transcriptomique et protéomique) de ces cellules. Les expériences ont révélé une corrélation entre la gravité de la maladie associée aux mutations et le phénotype des cellules cultivées. J'ai également observé les effets sélectifs de différentes mutations sur les interactions entre les protéines HCF-1 et l'expression des gènes.
De ces expériences, je conclus qu'il existe une corrélation entre les différentes classes de mutations du HCF-1 et leurs effets sur la prolifération cellulaire ainsi que sur le métabolisme de la cobalamine. Ces résultats indiquent que HCF-1 joue divers rôles dans les fonctions cellulaires qui peuvent être affectés dans les pathologies humaines.
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Les progrès récents de la biologie moléculaire ont ouvert de nouvelles possibilités de diagnostic et de traitement de nombreuses maladies rares jusqu'alors inconnues. Ainsi, récemment, grâce à la plus grande facilité de séquençage de l'ADN humain, des mutations de l'ADN de patients ayant des problèmes de métabolisme de la vitamine B12 ou présentant une déficience intellectuelle ont été découvertes. Certaines de ces mutations relèvent du gène HCFC1. Ce gène est connu pour coder une protéine appelée HCF-1 impliquée dans de nombreux processus cellulaires. Cette caractéristique est due à sa structure. Elle n'agit pas directement, mais réunit d'autres protéines pour les faire interagir entre elles et avec l'ADN pour réguler l'expression de nombreux autres gènes et permettre ainsi le bon fonctionnement de la cellule. Une mutation de HCF-1 peut entraîner une altération de l'expression génique et, par conséquent, des effets cellulaires graves et des maladies dans un organisme multicellulaire. Pour cette raison, ma thèse vise à comprendre plus profondément le fonctionnement moléculaire de cette protéine en voyant ce qui se passe au niveau cellulaire si elle est mutée en résidus suggérés par la nature des mutations d'HCF-1 trouvées dans des patients souffrant de maladies métaboliques ou intellectuelles.
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Human Host Cell Factor 1 (HCF-1), encoded by the X-linked HCFC1 gene, is an important component of a large number of transcriptional regulatory complexes involved in both activation and repression of gene expression. This régulation is in large part dépendent on interactions with both DNA binding proteins and chromatin modifiers through a conserved N-terminal so-called Kelch domain. With this plasticity it plays a rôle in both régulation of cell prolifération and metabolism.
Recent fmdings highlighted the importance of HCF-1 for human health or well-being: mutations in the coding sequence of its cognate gene are associated with the cblX cobalamin disorder phenotype and non-syndromic intellectual disability (NS-ID).
The molecular mechanisms underlying HCF-1 complex formation remain unclear as well as the précisé rôle of HCF-1 in cobalamin metabolism. My thesis exploits the information gathered from human HCFC1 genetics to understand HCF-1 interactions and rôles in human cells.
To address this aim I created seven mutant HEK-293 cell Unes that carry a single HCFC1 mutation thanks to the CRISPR-Cas9 technology. The selected mutations are ail in the HCF-1 Kelch domain. Five of these mutations are human-disease associated and fall into two groups: (i) cbl-X: Q68E, A73V, Al 15V and Y103H and (ii) NS-ID: S225N. Additionally, a historié HCFC1 temperature sensitive mutation, generated through genetic selection of chemically mutagenized baby hamster kidney cells, called P134S, as well as a missannotated NS-ID mutation (T239M) were included in the study.
I analysed both phenotypes (cell prolifération, mitochondrion morphology and metabolism) and the "-omics" (genomics, transcriptomics and proteomics) of these cells. The experiments revealed a corrélation between the severity of the disease associated to the mutations and of the phenotype of the cultured cells. I also observed selective effects of différent mutations on HCF-1-protein interactions and gene expression.
From these experiments, I conclude that there is a corrélation between différent classes of HCF-1 mutations and their effects on cell prolifération as well as cobalamin metabolism. These results indicate that HCF-1 plays varied rôles in cell functions that can be targets for disruption in human pathologies.