Chromosome organization and dynamics is regulated in all domains of life by the Structural Maintenance of Chromosomes complexes SMC (in capital letters, referring to the protein family). These complexes comprise a V-shaped dimer of elongated SMC subunits that harbour at one end an ATPase domain called “head” and a dimerization domain “hinge”, at the other end. Head and hinge are thus separated by a 50 nm antiparallel coiled coil “arm”. A kleisin subunit bridges the heads in an asymmetric way, forming a tripartite ring. The functions of multi-subunit SMC complexes span from sister chromatid cohesion and chromosome condensation to DNA damage repair. An attractive explanation for their variety of functions proposes that SMC complexes are loop extrusion machines that entrap DNA and translocate on it to form larger and larger DNA loops. This hypothesis was strongly supported by the first direct observations of loop extrusion in single-molecule experiments. How these complexes extrude DNA loops at the mechanistic level, however, remains largely unclear. The scientific questions of this thesis are focused on three molecular events that might be essential for the putative loop extrusion mechanism: (1) How SMC complexes accommodate the DNA within the tripartite ring? (2) Where does the SMC complexes bind DNA physically? And (3) how do SMC
subunits reshape when interacting with DNA?
Our approaches included in vitro and in vivo experiments using the Bacillus subtilis SmcScpAB complex as a model of study. We found that SmcScpAB entraps DNA in the space between the heads and the kleisin subunit, rather than entrapping it within the interarm space between the larger Smc subunits (Smc capitalized; used for the SmcScpAB subunit). We revealed that Smc subunits harbour a DNA binding interface at the heads that turned out to be essential for DNA entrapment and translocation. Furthermore, we provided evidence that ATP hydrolysis can occur in two different arm conformations. An inter-subunit contact within the long arms was important for arms dynamics and loading onto the chromosome.
Our results are consistent with previously reported mechanistic models for DNA loop extrusion, and it contributes new findings on SMC complexes that must be considered when proposing new models.
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L'organisation et la dynamique des chromosomes sont régulées dans tous les domaines de la vie par les complexes de maintien structurel des chromosomes SMC. Ces complexes comprennent un dimère en forme de V de sous-unités SMC allongées qui abritent à une extrémité un domaine ATPase appelé "tête" et un domaine de dimérisation "charnière", à l'autre extrémité. La tête et la charnière sont ainsi séparées par un "bras" de bobine antiparallèle de 50 nm. Une sous-unité de kleisin ponte les têtes de manière asymétrique, formant un anneau tripartite. Les fonctions des complexes SMC multi-sous- unités vont de la cohésion des chromatides sœurs et de la condensation des chromosomes à la réparation des dommages causés à l'ADN. Une explication intéressante de la variété de leurs fonctions propose que les complexes SMC sont des machines d'extrusion en boucle qui emprisonnent l'ADN et se déplacent sur celui-ci pour former des boucles d'ADN de plus en plus grandes. Cette hypothèse a été fortement soutenue par les premières observations directes de l'extrusion en boucle dans des expériences sur une seule molécule. Cependant, la manière dont ces complexes extrudent les boucles d'ADN au niveau mécanique reste largement incertaine.
Les questions scientifiques de cette thèse se concentrent sur trois événements moléculaires qui pourraient être essentiels pour le mécanisme d'extrusion de boucle supposé : (1) Comment les complexes SMC accommodent-ils l'ADN dans l'anneau tripartite ? (2) Où les complexes SMC se lient- ils physiquement à l'ADN ? Et (3) comment les sous-unités SMC se remodèlent-elles lorsqu'elles interagissent avec l'ADN ?
Nos approches comprennent des expériences in vitro et in vivo utilisant le complexe SmcScpAB de Bacillus subtilis comme modèle d'étude. Nous avons découvert que le complexe SmcScpAB piège l'ADN dans l'espace entre les têtes et la sous-unité kleisin, plutôt que de l'enfermer dans l'espace interarmées entre les sous-unités Smc plus grandes. Nous avons révélé que les sous-unités Smc abritent une interface de liaison de l'ADN au niveau des têtes qui s'est avérée essentielle pour le piégeage et la translocation de l'ADN. De plus, nous avons fourni des preuves que l'hydrolyse de l'ATP peut se produire dans deux conformations de bras différentes. Un contact entre les sous-unités au sein des bras longs était important pour la dynamique des bras et la charge sur le chromosome.
Nos résultats sont cohérents avec les modèles mécaniques précédemment rapportés pour l'extrusion de boucle d'ADN, et ils apportent de nouvelles découvertes sur les complexes SMC qui doivent être prises en compte lors de la proposition de nouveaux modèles.