Mammalian genomes are rich in regions containing information that is transcribed into RNA but not translated into protein. A subset of these transcripts, long intergenic non-coding RNAs (lincRNAs), has been implicated in regulation of gene expression, both transcriptionally and post­ transcriptionally, particularly in development and cell fate decisions. For example, lincRNAs can regulate the levels of pluripotency- and differentiation-specific transcription factors through post­ transcriptional decoy of microRNAs (miRNAs) targeting these genes, thereby leading to their derepression and activation of downstream pathways. LincRNAs that regulate their targets in this miRNA-dependent manner are called competitive endogenous RNAs (ceRNAs). Here, I functionally characterized three ceRNA candidates in mouse embryonic stem cells (mESCs) previously described to regulate the pluripotency/differentiation axis. mESCs maintain pluripotent identity through expression of core pluripotency transcription factors Oct4, Nanog, and Sox2, in conjunction with repression of lineage-specification transcription factors. With the use of a conditional Dicer1 knockout, where the expression of miRNAs is abrogated, I investigated the expression profiles of mESCs following knockdown of ceRNA candidates in the presence and absence of miRNAs. I found that none of the three candidates display clear signatures of ceRNA activity; however, all three modulate the expression of genes involved in the regulation of pluripotency maintenance and/or differentiation in a miRNA-independent manner. In particular, the knockdown of one of the candidates, linc-MoP, a mESC-specific lincRNA, led to a significant downregulation of Nanog. Upon further analysis, I found that linc-MoP is an enhancer-derived lincRNA (elincRNA). elincRNAs have been described to regulate gene expression in cis through modulation of local chromosome architecture that results in increased transcription of their targets. In mESCs, the knockdown of linc-MoP led to decreased Nanog levels and consequent spontaneous differentiation. Linc-MoP knockdown also led to the downregulation of genes in the BMP/SMAD pathway, which directly control the expression of pluripotency transcription factors. Furthermore, the expression of a protein-coding gene in cis with the locus of linc-MoP, Mani, was significantly decreased following linc-MoP knockdown. Chromosome conformation capture revealed that linc­ MoP and the promoter of Mani form an enhancer-promoter loop, the DNA-DNA contact frequency of which correlates with linc-MoP transcriptional output and is specific to mESCs. Further mechanistic analyses revealed this regulation is likely transcription-dependent. The expression of both linc-MoP and Mani is repressed by pluripotency transcription factors, including Nanog. Thus, linc-MoP, Mani, and Nanog form a feedback loop that may act as a safeguard against spontaneous differentiation resulting from intrinsic fluctuations of Nanog: the downregulation ofthis transcription factor leads to derepression of linc-MoP and subsequently of Mani, which rescues the expression of Nanog and allows mESCs to remain pluripotent. This work uncovered a new layer of regulation of cell identity in mESCs and provides mechanistic insights into how elincRNAs regulate their targets in cis.
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Le génome des mammifères contient de nombreuses régions dont l'information peut être transcrite en ARN sans être traduite en protéines. Un sous-ensemble de ces transcrits, les ARNs longs non codants intergéniques (lincRNAs), joue un rôle dans la régulation de l'expression des gènes au niveau transcriptionnel et post-transcriptionnel, notamment lors du développement et des décisions concernant le destin cellulaire. Les lincRNAs qui régulent l'expression de facteurs de transcription lié à la différenciation et la pluripotence grâce aux microRNAs (miRNAs), appelés des ARNs endogènes compétitifs (ceRNAs), ciblent les gènes lors de la post-transcription, entraînant ainsi la dérépression et l'activation de voies en aval. Dans cette étude, j'ai caractérisé fonctionnellement trois candidats ceRNA connus pour leur rôle dans la régulation de la pluripotence/différentiation dans des cellules souches embryonnaires de souris (CSEs). Les CSEs maintiennent leur identité pluripotente par l'expression de facteurs de transcription liés à la pluripotence, soit Oct4, Nanog et Sox2, en combinaison avec la répression de facteurs de transcription lié à la spécification de la lignée. J'ai analysé le profil d'expression des CSEs suite à une l'inactivation de ces candidats en présence ou absence des miRNAs dans un modèle où Dicer1 est inactivé conditionnellement menant à une expression réprimée des miRNAs. J'ai démontré qu'aucun des trois candidats présentaient une signature liée à l'activité des ceRNAs. Toutefois, ces derniers pouvaient moduler l'expression des gènes associée à la régulation du maintien de la pluripotence et/ou à la différenciation indépendamment des miRNAs. De fait, l'inactivation de linc-MoP, un lincRNA spécifique aux CSEs, a mené à une diminution significative de Nanog. J'ai observé que linc-MoP est un lincRNA dérivé d'un enhancer (elincRNA). Les elincRNAs sont associés à la régulation de l'expression des gènes en cis par la modulation de l'architecture locale des chromosomes menant à une augmentation de la transcription de leurs cibles. Dans les CSEs, l'inactivation de linc-MoP a également mené à la diminution de l'expression des gènes de la voie BMP/SMAD, qui contrôlent directement l'expression des facteurs de transcription associés à la pluripotence. De plus, l'expression d'un gène codant pour les protéines en cis avec le locus de linc-MoP, i.e., Mani, était significativement diminuée suite à l'inactivation de linc-MoP. La capture de la conformation du chromosome démontre que linc-MoP et le promoteur de Mani forment une boucle promoteur-enhancer, dont la fréquence de contact ADN­ ADN corrèle avec la production transcriptionnelle de linc-MoP et est spécifique aux CSEs. Des analyses mécanistiques supplémentaires ont révélé que cette régulation est probablement dépendante de la transcription de linc-MoP. L'expression de linc-MoP et Mani est réprimée par des facteurs de transcription de la pluripotence, notamment Nanog. Ainsi, linc-MoP, Mani, et Nanog forment une boucle de rétroaction qui peut protéger contre une différenciation spontanée résultant d'une fluctuation intrinsèque de Nanog. La diminution de l'expression de ce dernier mène à la dérépression de linc-MoP suivi de Mani, qui rétablit l'expression de Nanog et permettent aux CSEs de garder leur identité pluripotente. Cette étude souligne un nouveau niveau de régulation de l'identité cellulaire dans les CSEs et fournit un mécanisme lié à la régulation des elincRNAs de leurs cibles en cis.