RNA modifications represent a recently uncovered new and complex layer of gene expression regulation. Nowadays, more than 170 RNA modifications are known in all kingdoms of life and on all kind of RNA such as tRNA, rRNA and mRNA. Amongst the most abundant modifications on mRNA is N6-methyladenosine (m6A). m6A is enriched in the nervous system, and its dysregulation results in severe neuronal defects by modulation of the RNA metabolism. Mechanistically, m6A functions through the recruitment of specific reader proteins, mainly YTH domain containing proteins. While mammals have five YTH proteins, which have been all associated to m6A dependent functions, the role of the single cytoplasmic YTH protein homolog in Drosophila, Ythdf, remains elusive. I found that Ythdf modulates the translation efficiency of its m6A-modified targets dependent on the cellular context.
Moreover, the loss of m6A and Ythdf results in an axonal overgrowth at the larval neuromuscular junctions and in the adult mushroom bodies. I identified an interplay of Ythdf and the Fragile X mental retardation protein to be essential for limiting axonal growth by inhibiting the translation of neuronal key transcripts.
Moreover, we aimed to establish new techniques applicable in vitro and in vivo to detect m6A-modified transcripts with minimal RNA input requirement. For this purpose, I adapted the TRIBE approach as an elegant tool to identify m6A modified transcripts.
Furthermore, I found that m6A regulates key components of the Drosophila circadian dock. The circadian dock is an essential oscillating molecular mechanism regulating numerous cellular and physiological processes in every organism. It repeats every 24 hours and is influenced by the solar light. I found that m6A mutants display a light-dependent dysregulation of essential circadian transcripts and, vice versa, the circadian dock is influencing the m6A deposition.
Besicles m6A, a subset of additional modifications is present on mRNA, such as Adenosine-to-lnosine (A-to-1) editing. The A-to-1 editing is catalyzed by Adar enzymes. Inosine is recognized from the cellular machinery as guanosine and, therefore, editing can lead to i.e. recoding events that influence the fonction of the translated protein. Interestingly, I identified a modulation of the A-to-1 editing by m6A, partially mediated by the m6A reader protein Fragile X mental retardation protein. In line with that, I found that the loss of m6A has differential effects on the capacity of Adar to bind to its mRNA targets.
Finally, we aimed to unravel the physiological role ofNsun6, a conserved tRNA m5C-methyltransferase, which has been recently proposed to catalyze the deposition ofm5C on mRNA. I demonstrated that the loss of Nsun6 in Drosophila leads to sex-specific locomotion defects and impairs higher cognitive fonctions.
Overall, our data provide nove! insights into the physiological role and functional mechanism of multiple epitranscriptomic marks.
--
Les modifications de l'ARN représentent une voie nouvelle et complexe récemment découverte de la régulation de l'expression génique. Actuellement, plus de 170 modifications d'ARN sont connues dans tous les règnes de la vie et sur tous les types d'ARN tels que l'ARNt, l'ARNr et l'ARNm. Parmi les modifications les plus abondantes sur l'ARNm figure la N6-méthyladénosine (m6A). m6A est enrichi dans le système nerveux, et sa dérégulation entraîne de graves défauts neuronaux par modulation du métabolisme de l'ARN. m6A fonctionne par la reconnaissance de protéines spécifiques, principalement celles qui contiennent le domaine YTH. Alors que les mammifères ont cinq protéines YTH, qui ont toutes été associées à des fonctions dépendantes de m6A, le rôle de l'unique homologue de la protéine YTH cytoplasmique chez la drosophile, Ythdf, demeure inconnu. J'ai constaté que Ythdf module l'efficacité de la traduction de ses cibles methylées en fonction du contexte cellulaire. De plus, la perte de m6A et Ythdf entraîne une croissance axonale au niveau des jonctions neuromusculaires larvaires et dans le système nerveux central adulte. J'ai identifié une interaction entre Ythdf et la protéine FMRP qui est importante pour limiter la croissance axonale en inhibant la traduction de certains transcrits qui jouent des rôles clés dans le système nerveux.
De plus, nous avons cherché à établir des nouvelles techniques applicables in vitro et in vivo pour détecter les transcrits modifiés par m6A en utilisant une faible quantité d'ARN de départ. J'ai adapté la méthode TRIBE (Targets of RNA binding protein Identified By Editing) comme un outil élégant pour identifier les transcrits modifiés par m6A.
De plus, j'ai découvert que m6A régule les intervenants clés de l'horloge circadienne de la drosophile. L'horloge circadienne est un mécanisme moléculaire oscillant essentiel qui régule de nombreux processus cellulaires et physiologiques dans chaque organisme. Il se répète toutes les 24 heures et est influencé par la lumière solaire. J'ai observé que certains transcrits circadiens étaient dérégulés dans les mutants m6A et que cette dérégulation était dépendante de la lumière. Inversement, j'ai montré que l'horloge circadienne influence la déposition de m6A.
Outre m6A, un certain nombre d'autres modifications est présent sur l'ARNm, comme par exemple l'édition adénosine-to-inosine (A-to-1). L'édition A à I est catalysée par les enzymes Adar. L'inosine est reconnue par la machinerie cellulaire comme guanosine et, par conséquent, l'édition peut conduire à des événements de recodage qui influencent la fonction de la protéine traduite. De façon intéressante, nous avons identifié une modulation de l'édition A à I par m6A, partiellement médiée par la protéine FMRP. De plus, la perte de m6A a des effets différentiels sur la capacité d'Adar à se lier à ses cibles d'ARNm.
Enfin, nous avons cherché à déterminer le rôle physiologique de Nsun6, une méthyltransférase conservée au cours de l'évolution connue pour catalyser la modification m5C sur les ARN de transfer, et qui a récemment été proposée pour catalyser également la déposition de m5C sur l'ARNm. J'ai constaté que la perte de Nsun6 chez la drosophile entraîne des défauts de locomotion, qui sont spécifiques au sexe, et altère les fonctions cognitives supérieures.
Pour résumer, nos données fournissent de nouvelles informations sur le rôle physiologique et le mécanisme fonctionnel de plusieurs marques épitranscriptomiques chez la drosophile.