Résumé
La vitesse de dégradation d'un ARN messager est fonction non seulement de l'ARN lui-même, mais aussi du contexte dans lequel la cellule se trouve et des signaux qu'elle reçoit. Parmi toutes les séquences capables d'influencer la stabilité d'un ARN messager, les éléments riches en A et U (ARE) sont les éléments déstabilisants les plus répandus et les mieux caractérisés. Les AREs sont localisés dans les régions 3' non traduites de nombreux ARNs, codant pour des cytokines (des interleukines ou le TNFa par exemple), des facteurs de croissance (GM-CSF) ou des proto-oncogènes (c-myc, c-fos). La présence des AREs stimule à la fois la désadénylation et la dégradation de l'ARN messager. Les détails du mécanisme ne sont pas encore connus. Mon travail a consisté à étudier les facteurs impliqués dans la dégradation de ces ARNs, en tentant d'en découvrir de nouveaux d'une part et, d'autre part, en surexprimant un de ces facteurs pour déterminer son rôle, le tout dans des cellules de mammifères.
Dans la première partie de ma thèse j'ai tenté d'identifier de nouveaux facteurs impliqués dans la dégradation rapide des ARNs messagers contenant un ARE. Pour ce faire j'ai essayé de créer et d'isoler des cellules mutantes incapables de dégrader rapidement de tels ARNs. Divers constructions ont été introduites dans des cellules CHO. Ces constructions contenaient la séquence codant pour la GFP, fusionnée aux régions 3' non traduites des ARNs humains de GM-CSF, de l'interleukine-6 (IL-6), de c -jun et de c -fos. Les éléments provenant d'IL-6 et de GM-CSF se sont révélés suffisants pour déstabiliser l'ARN messager de la GFP. Par contre, la région 3' non traduite de l'ARN de c -fos n'a pas eu le même pouvoir. Aucune lignée cellulaire contenant la construction GFP -jun n'a pu être isolée. La lignée cellulaire contenant la construction GFP-IL-6 a été soumise à un traitement de mutagenèse chimique avec de l'ICR-191. Des populations mutantes ont été sélectionnées, en se basant sur une expression accrue de la GFP. Ces populations ont été sous-clonées et plusieurs clones de chacune d'entre elles ont été analysés plus en détails. La taille de la région 3' non traduite de la construction GFP-IL-6 a été contrôlée, de même que la stabilité de l'ARN messager. Tous les mutants étudiés avaient une mutation en cis ou une demi-vie inchangée. Aucune lignée cellulaire déficiente pour la dégradation des ARNs contenant des AREs n'a donc pu être isolée.
Dans la seconde partie de mon travail, j'ai étudié hnRNP D, un des facteurs régulant la dégradation des ARNs contenant des AREs. Plusieurs facteurs de ce type ont été identifiés. Certains stabilisent l'ARN comme HuR, tandis que d'autres se sont révélés être déstabilisants, comme TTP ou les membres de sa famille. Ces derniers sont censés recruter l'exosome et induire la dégradation de l'ARN après la désadénylation. Le rôle de hnRNP D est plus controversé dans la littérature qui lui a attribué un rôle stabilisant ou déstabilisant selon les groupes. C'est pourquoi l'effet de la surexpression de hnRNP D sur des ARNs reporters a été testé dans des cellules 3T3. L'ARN reporter a été construit de telle sorte que l'addition d'un analogue de la tétracycline au milieu de culture permet de bloquer spécifiquement la transcription de cet ARN et, par conséquent, de mesurer sa vitesse de dégradation. Les ARNs reporters étaient constitués comme précédemment de la GFP fusionnée aux régions 3' non traduites de IL-6 et de GM-CSF. Un deuxième système, introduit dans les mêmes cellules, a permis de surexprimer hnRNP D de façon inductible et de mesurer les changements de stabilité qui en découlaient. La surexpression d'hnRNP D a augmenté spécifiquement la demi- vie des constructions GFP-IL-6 et GFP-GM-CSF. Les résultats obtenus étaient fonction de F isoforme d'hnRNP D surexprimée. Les deux versions les plus courtes de la protéine ont fortement stabilisé les ARNs reporters, tandis que p45 et p42 n'ont eu qu'un effet mineur, voire insignifiant. Parallèlement à cette étude, j'ai également montré que l'activation de la protéine kinase C pouvait jouer un rôle dans la stabilisation des ARNs messagers possédant un ARE.
Abstract
Different mRNAs can exhibit marked differences in degradation rates within the same cell, and the turnover rates of individual mRNAs can also vary significantly in response to changes in the cellular environment. Best characterized among the RNA sequences that influence mRNA stability are the adenylate, uridylate-rich instability elements (AREs), usually found in the 3' untranslated regions (UTRs) of short-lived mRNAs such as those encoding cytokines (interleukins, interferon, tumour necrosis factor a), growth factors (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) and proto-oncogenes (c-fos, c-myc). AREs have been shown to enhance both deadenylation rates and mRNA degradation, although the precise mechanism is not yet known. My work consisted in studying trans-acting factors involved in ARE-triggered mRNA decay in mammalian cells, by trying to discover new ones, and in a second part, by overexpressing a known factor to determine its role.
The aim of the first part of my thesis was to discover and identify new factors and enzymes involved in ARE-triggered mRNA decay. I therefore tried to generate and isolate somatic cell mutants defective for rapid mRNA decay. The GFP coding sequence, followed by human ARE-containing 3'UTRs of IL-6, GM-CSF, c-jun and c-fos mRNAs, was expressed in CHO. The 3'UTRs of IL-6 and GM-CSF destabilised the GFP mRNA. In contrast, the 3'UTR of c -fos was not sufficient. No adequate cell-line expressing the GFP -jun construct could be isolated. The cell-line expressing unstable GFP-IL-6 mRNA was mutagenized with ICR-191 and somatic mutants were isolated by FACS, according to their increase in GFP expression. Populations were subcloned and several clones were analysed. The length of the GFP-IL-6 mRNA 3'UTR was controlled and the mRNA stability measured. All the mutants bear c/s-mutations or displayed no change in mRNA half-life. No somatic mutants with a defect in trans-acting factors were found.
The second part of my work consisted in studying hnRNP D, a trans-acting factor regulating ARE-mediated mRNA decay. Several ARE-binding proteins have been identified: some like HuR stabilise the mRNAs whereas others like tristetraprolin (TTP) and members of its family (Tis11B, Tis11D) have destabilising properties. TPP (and its family members) are thought to recruit the exosome and induce mRNA decay after deadenylation. According to the literature, stabilising and destabilising functions have been attributed to the hnRNP D protein. To test the effect of hnRNP D overexpression on the stability of short-lived ARE-containing mRNAs in mouse 3T3 cells, I first set-up a reporter tetracycline-regulated reporter system in which we can specifically block transcription and measure mRNA decay. Reporter mRNAs consisted in a fusion between the GFP sequence and the 3'UTRs of human IL-6 and GM- CSF. I then overexpressed the four hnRNP D isoforms using the GeneSwitch system in the same cell and measured changes in reporter mRNA stability. According to my data, hnRNP D overexpression specifically stabilised the GFP mRNA fused to the 3'UTR of IL-6 or GM- CSF, but not to the same extend for the four isoforms. p37 and p40 strongly increased the half-lives of the reporters whereas p45 had only a little stabilising effect and p42 no significant effect at all. In parallel to this, I also showed that activation of protein kinase C stabilised the unstable GFP-IL-6 mRNA.