Résumé
Les cellules répondent continuellement aux modifications induites par leur environnement en activant des cascades de signalisation dépendantes de stimuli extracellulaires. Ces voies de signalisation permettent une propagation spécifique du signal, ayant pour but de fournir une réponse adéquate à un stimulus donné. Parmi ces voies de signalisation, on trouve celles des MAPKs : elles sont généralement composées de 3 protéines kinases disposées en cascade qui s'activent séquentiellement par phosphorylation. Une fois activées, les MAPKs phosphorylent à leur tour différents substrats tels que des facteurs de transcription ou des protéines. Les MAPKs régulent de ce fait la prolifération, la différentiation et la survie cellulaires en contrôlant aussi bien l'expression de certains gènes que la régulation de protéines fonctionnelles. Chez les mammifères, trois familles de MAPKs ont été répertoriées : ERK, p38 et JNK. Les différentes JNKs sont activées aussi bien par des stress environnementaux que par des cytokines pro-inflammatoires telles que IL-1β et TNFα.
Un type particulier de protéines, appelées « échafaud », permettent l'organisation des kinases en cascade en s'y liant par des domaines d'interaction distincts. La protéine « échafaud » IB1 (JIP1) a été identifiée spécifiquement pour la voie JNK et lie JNK ainsi que ses kinases activatrices MLK3 et MKK7. La sur-expression du domaine de liaison à JNK (JNK Binding Domain ou JBD) de IB1 cause une rétention de JNK dans le cytoplasme et inhibe la phosphorylation induite par JNK de plusieurs facteurs de transcription. D'autre part, dans le diabète de type I, la voie de signalisation JNK est impliquée dans l'apoptose massive induite par les cytokines des cellules pancréatiques β sécrétrices d'insuline.
Afin de mieux comprendre le rôle de cette protéine « échafaud » et son implication dans la voie de signalisation JNK, nous avons étudié les interactions existant entre elle, JNK, ainsi que les kinases activatrices et les différents substrats de JNK. Dans un premier temps, nous avons cloné le second membre de la famille des IB, nommé IB2. IB2 est exprimé exclusivement dans le cerveau et les cellules pancréatiques β. Nous avons démontré que IB2 lie JNK et sa kinase activatrice MKK7. Une sur-expression de son domaine de liaison à JNK diminue de manière significative l'apoptose induite par IL-1β dans les cellules pancréatiques β. Nous avons ensuite généré des peptides inhibiteurs de JNK en se basant sur la structure d'IBl et d'IB2, que nous avons appelé JNKI1 et JNKI2 pour JNK inhibiteurs 1 et 2. JNKI1 possède une action inhibitrice beaucoup plus forte que celle observée pour JNKI2. Ces peptides ont été couplés à un transporteur dérivé d'un facteur nucléaire du VIH qui permet l'entrée des peptides dans les cellules. Ces molécules bloquent efficacement la phosphorylation in vitro de facteurs de transcription induite par trois isoformes de JNK. Par ailleurs, dans des modèles cellulaires, JNKI1 et JNKI2 bloquent aussi la phosphorylation de c-Jun induite par des stress tels que IL-1β ou les UV. Afin de tester la spécificité inhibitrice de ces peptides, nous avons étudié les interactions établies entre JNK et ses divers substrats en présence ou non des peptides. Les résultats obtenus démontrent qu'il existe deux modes de liaisons à JNK selon les substrats répertoriés, JBD-dépendant ou JBD-indépendant. Les peptides inhibiteurs, pouvant ainsi contrôler l'accessibilité de certains substrats à JNK, influencent considérablement les mécanismes régulateurs de la mort ou la survie des cellules. De telles molécules pourront constituer une approche thérapeutique intéressante pour traiter les maladies résultant d'un disfonctionnement des voies de signalisation.
Summary
Cells are continuously responding to changes of their environment by activating extracellular stimuli-dependent signal transduction cascades. These evolutionary conserved pathways allow a specific signal propagation leading to an appropriate answer from a particular stimulus. Amongst these signaling pathways are the MAPKs pathways: they are typically organized in a three-kinase module or signaling cascade that are activated by sequential phosphorylation. Once activated, the MAPKs phosphorylate various substrates such as transcription factors or proteins. Thus, the MAPKs regulate cellular proliferation, differentiation and survival by controlling both gene expression and the regulation of functional proteins. In mammals, three MAPKs families have been identified: ERK, p38 and JNK. The JNKs are activated by both environmental stresses and pro-inflammatory cytokines such as IL-1β and TNFα.
A distinct type of proteins, the scaffold proteins, organizes the MAPKs in cascade by binding to the kinases through specific interactions domains. IB1 (JIP1), a JNK-specific scaffold protein, binds JNK and its activating kinases MLK3 and MKK7. Overexpression of the JNK binding domain of IB1 (JBD) causes cytoplasmic retention of JNK and inhibits JNK-mediated phosphorylation of several transcription factors. Moreover, in type I diabetes, the JNK signaling pathway is implicated in apoptosis of insulin secreting pancreatic β-cells.
To better understand the role of the IB1 scaffold protein and its contribution in the JNK signaling pathway leading to pancreatic β-cells death, we studied the interactions between IB1, JNK and its activating kinases and the different substrates of JNK. First, we cloned the second member of the IB family, named IB2. IB2 is,expressed specifically in brain and in pancreatic β-cell lines. Furthermore, we demonstrated that IB2 binds JNK and its activating kinase MKK7. Overexpression of the JBD of IB2 decreases also significantly IL-lβ-induced apoptosis in pancreatic β-cells. Thereafter we generated inhibitory peptides based on the amino acid sequence of IB1 and IB2, that we called JNKI1 and JNKI2 for JNK Inhibitor 1 and 2. JNKI1 exhibits a more efficient inhibition of the interaction than JNKI2. Such peptides were coupled to a transporter derived from the HIV-TAT nuclear factor to translocate across the cell membrane. These peptides efficiently block the phosphorylation induced by three JNK isoforms on the c-Jun transcription factor. Moreover, JNKI1 and JNKI2 also block the c-Jun phosphorylation induced by stresses such as IL-1β or UV. To test the inhibitory specificity of these peptides, we studied the interaction between JNK and its other substrates in presence or in absence of the peptides. Our results showed that JNK binds its substrates either by a JBD-dependent or a JBD-independent manner. By controlling the accessibility of selected substrates to JNK, these peptides influence considerably various regulators of death or survival of the cells. Such molecules may constitute an interesting approach to treat diseases resulting from a dysfunction of signaling pathways.