The study of RNA modifications, today known as epitranscriptomics, is of growing interest. The N6-methyladenosine (m6A) and 5-methylcytosine (m5C) RNA modifications are abundantly present on mRNA molecules, and impact RNA interactions with other proteins or molecules, thereby affecting cellular processes, such as RNA splicing, export, stability and translation. Recently m6A and m5C marks were found to be present on human immunodeficiency (HIV) transcripts as well and affect viral replication. Therefore, the discovery of RNA methylation provides a new layer of regulation of HIV expression and replication, and thus a novel array of opportunities to inhibit replication. However, no study has been performed to date to investigate the impact of HIV replication on the transcript methylation level in the infected cell.
To achieve this goal, we used a productive HIV infetion model, consisting of the CD4+ SupT1 T cell line infected with a VSV-G pseudotyped HIVeGFP-based vector, to explore the temporal landscape of m6A and m5C epitranscriptomic marks upon HIV infection, and compare it to mock-treated cells. Cells were collected at 12, 24 and 36h post-infection for mRNA extraction and FACS analysis. M6A RNA modifications were investigated by methylated RNA immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing (MeRIP-Seq). M5C RNA modifications were investigated using a bisulfite conversion approach followed by high-throughput sequencing (BS-Seq).
Our data suggest that HIV Infection impacted the methylation landscape of HIV-infected cells, inducing mostly increased methylation upon infection. Indeed, differential methylation (DM) analysis identified 62 m6A hypermethylated and only 2 hypomethylated transcripts and 14 m5C hypermethylated transcripts and 7 hypomethylated ones. Similar to differential expression analysis, we reasoned that differential methylation analysis may reveal novel factors potentially acting as HIV dependency factors (HDF) or HIV inhibitory factors (HIF), therefore impacting viral replication success. Further characterization of putative HDF/HIF DM genes, using CRISPR-Cas9-mediated knock-out approach followed by HIV_GFP infection, is necessary to validate their role on viral replication. Furthermore, both m6A and m5C methylation was detected on viral transcripts, as previously described, but additional patterns were identified. Altogether, our study provides the first overview of the epitrantranscriptome landscape of HIV-infected cells and offers novel opportunities to identify cellular factors impacting the viral replication success.
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L'étude des modifications de l'ARN, aujourd'hui appelée épitranscriptomique, suscite un intérêt croissant.
Les modifications N6-méthyladénosine (m6A) et 5-méthylcytosine (m5C) de l'ARN sont abondamment présentes sur les molécules d'ARN messager (ARNm). Elles peuvent avoir un impact sur les interactions entre l'ARN et les autres molécules ou protéines, et être affectées ainsi lors de processus cellulaires, tels que l'épissage, l'exportation, la stabilité et la traduction des ARNm. Les modifications m6A et m5C ont récemment été identifiées également sur les transcrits du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) avec un rôle sur la réplication virale. La découverte de la méthylation de l'ARN du VIH offre un niveau additionnel de régulation de l'expression et de la réplication du VIH, et donc une nouvelle gamme d'opportunités pour inhiber la réplication. Cependant, aucune étude n'a été réalisée à ce jour visant à étudier l'impact du VIH sur le niveau de méthylation des transcrits dans la cellule infectée. Pour ce faire, nous avons utilisé un modèle productif d'infection à VIH, soit une lignée de cellules T, SupT1, infectées par le vecteur viral HIVeGFP pseudotypé à l’aide d’une enveloppe VSV-G, afin d’explorer le profil temporel des marques épitranscriptomiques m6A et m5C lors de l’infection VIH et de le comparer à celui des cellules non-infectées. Des cellules ont donc été collectées 12, 24 et 36 heures après l'infection en vue de l'extraction de leur ARNm et de leur analyse par FACS. Les modifications m6A ont été investiguées à l’aide de l’immunoprécipitation de l'ARN méthylé, suivie d'un séquençage à haut-débit (MeRIP-Seq). Les modifications m5C ont été étudiées en utilisant une approche de conversion au bisulfite suivie d'un séquençage à haut-débit (BS-Seq).
Nos données révèlent que l'infection du VIH impacte le profil de méthylation des cellules infectées, en induisant principalement une augmentation de la proportion de méthylation lors de l'infection. L'analyse de méthylation différentielle (DM) a identifié 62 transcrits hyperméthylés et 2 transcrits hypométhylés pour la marque m6A et 14 transcrits hyperméthylés et 7 hypométhylés pour la marque m5C. Comme pour les analyses d’expression différentielle des gènes, nous avons émis l’hypothèse que l’analyse différentielle du taux de méthylation des transcrits pouvait révéler de nouveaux acteurs cellulaires, agissant potentiellement en tant que facteurs facilitant l’infection virale (HIV Dependency Factors, HDF) ou au contraire l’inhibant (HIV Inhibitory Factors, HIF). La caractérisation de ces HDF/HIF potentiels, par une invalidation génique par approche de type CRISPR-Cas9, est donc nécessaire pour valider leur rôle sur la réplication virale. De plus, les méthylations m6A et m5C ont également été détectés sur les transcrits viraux, comme décrit précédemment, mais de nouvelles régions ont été identifiées. En conclusion, notre étude présente la première vue d’ensemble du profil épitranscriptomique des cellules infectées par le VIH et offre de nouvelles opportunités d’identifier des facteurs cellulaires impliqués dans la réplication virale.