Les protéines sont des molécules essentielles impliquées dans presque tous les processus moléculaires des organismes vivants. Elles catalysent les réactions biochimiques, transmettent les signaux et peuvent également se lier à divers composés organiques ou inorganiques. La famille des protéines de liaison périplasmique (PBP) est une classe importante de protéines de liaison au substrat (SBP). Leur particularité est de lier diverses molécules comme des métaux, des sucres ou encore des peptides. Du fait de cette singularité, elles ont fait l'objet de nombreuses recherches scientifiques et ont suscité un grand intérêt. La protéine périplasmique RbsB d'Escherichia coli pouvant lier le ribose a soulevé un intérêt particulier de par sa capacité à lier le ribose pour ensuite le libérer à l'intérieur de la cellule, via des transporteurs ABC, ou encore de modifier les déplacements des bactéries via leur système chimiotactique. En 1994, J. W. Baumgartner a développé un récepteur hybride original permettant de relier la propagation du signal à l'expression d'une protéine rapportrices. De ce fait, les souches bactériennes modifiées se comportent comme des biocapteurs répondant à une concentration croissante de ribose par une augmentation de fluorescence à la place de la réponse chimiotactique habituellement observée. En 2003, L. L. Looger a été en mesure de modifier les propriétés de liaison de la protéine RbsB en se basant sur des prédictions in silico. Les affinités prédites des protéines de liaison modifiées ont ensuite été vérifiées par des expériences in vitro et in vivo. Dans cette étude, nous nous sommes particulièrement intéressés à une protéine mutante nommée TNT.R3 qui, au lieu de lier le ribose, pourrait se lier au trinitrotoluène (TNT) avec une affinité de 2 nM.
La première partie de ce travail a été consacrée à reproduire le biocapteur au TNT dans le but de développer une protéine RbsB pouvant lier d'autres ligands. Le biocapteur au TNT a été reproduit en se basant sur les recherches publiées. Malheureusement, aucune affinité pour le TNT n'a été constaté, bien que le biocapteur E. coli pour le ribose s'est révélé être très sensible à présence de ribose. Les deux protéines RbsB et TNT.R3 ont été purifiées permettant ainsi une étude approfondie des propriétés de liaison par titrage calorimétrique isotherme. Alors que RbsB lie le ribose comme attendu, la protéine TNT.R3 ne lie ni le ribose, ni le TNT. Cela nous a mené à la conclusion que la publication était incorrecte au sujet de la capacité de la protéine TNT.R3 de lier le TNT et à la possibilité d'utilisation d' E. coli exprimant TNT.R3 comme biocapteur pour le TNT. De plus, les connaissances sur le rôle des différents acides aminés dans le fonctionnement de RbsB n'étaient pas suffisantes.
La deuxième partie de ce travail a été consacrée à une caractérisation plus complète du rôle des différents acides aminés dans le fonctionnement de RbsB. A cet effet, un « balayage alanine » de la protéine dans son ensemble a été réalisé, soit chaque acide aminé a été individuellement remplacé par une alanine. Tous les mutants ont été exprimées dans E. coli possédant le récepteur hybride, ce qui a permis d'étudier à la fois l'induction par le ribose, ainsi que l'abondance périplasmique d'une sélection de mutants par rapport à RbsB. Plusieurs mutations discrètes dans RbsB affectant fortement sa fonctionnalité ont été identifiées en dehors de la région de liaison au ribose - affectant la signalisation et / ou la production. Plusieurs mutations affectant les fonctionnalités de RbsB avaient déjà été identifiées lors de la conception de TNT.R3. Une étude approfondie nous a permis de démontrer que la mutation D89A située dans cavité de liaison au ribose induit un effet négatif sur l'affinité de la protéine pour ce dernier. En revanche, la mutation N190A, située à proximité de D89, n'a révélé aucune influence sur la liaison au ribose. Cependant une altération de la stabilité de la protéine a été observée. Finalement, cette analyse systématique de RbsB a permis de générer un grand nombre de données empiriques, qui permettront des prédictions bien plus précises lors de futurs travaux de modification de RbsB, du fait de l'augmentation de la précision prédictive des algorithmes de simulation.
Dans la troisième partie de ce travail, nous nous sommes concentrés sur la conception de nouveaux mutants en partant de RbsB de type sauvage pour arriver à un gain de fonction pour des substances similaires au ribose, notamment le 1,3-cyclohexanediol (13CHD). Environ deux millions de mutants ont été prédits in silico avec un récepteur hybride d'E coli utilisant une protéine fluorescente verte comme réponse. Ces deux millions de mutants ont été, par la suite, criblés en utilisant la cytométrie du flux (FACS). Cependant, l'utilisation de cette technique présente des désavantages comme l'obtention de faux positifs ne pouvant pas être complètement isolés même par procédé de purification cyclique. Néanmoins, cette étude nous a permis d'identifier une protéine mutante liant le 13CHD avec 1,3 fois plus d'affinité que la protéine de type sauvage non modifiée. Ces résultats mettent en évidence le potentiel des protéines de liaison périplasmique ainsi que l'importance d'un système de criblage efficace.
Malgré le potentiel que représente la biologie synthétique et la conception de protéines pour obtenir une liaison artificielle de ligands pour le développement de nouveaux biocapteurs, une meilleure compréhension des réseaux hautement ramifiés et complexes d'interactions protéine-protéine ainsi que des efforts considérables pour produire des données empiriques sont nécessaires.
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Proteins are essential molecules involved in almost ail molecular processes of an organism. A specific class of substrate-binding proteins, the periplasmic binding proteins (PBPs) has raised interest within the scientific community during the last decades. They are present in many organisms and are able to bind various molecules. This work was focused on the ribose-binding periplasmic protein RbsB from Escherichia coli. This protein is able to bind ribose and either release it into the cytoplasm via ABC transporters or to alter the cell's swimming behavior through its chemotaxis system. In 1994, a novel hybrid receptor was assembled by G. L. Hazelbauer's group. The hybrid protein links the RbsB signal propagation to the expression of a reporter protein. Thus, the modified bacterial strain acts as a biosensor responding to a rising ribose concentration with an increased level of fluorescence. In 2003, L. L. Looger proposed a reengineered RbsB protein with revised binding properties using computational simulations; predicted affinities were verified by in vitro and in vivo experiments. The mutant protein TNT.R3 was of particular interest due to its ability to bind trinitrotoluene (TNT) with an affinity of 2 nM.
In the first part of my work, we initiated an attempt to reproduce the TNT biosensor in order to further develop biosensors based on RbsB with new ligand-binding specificities. Surprisingly and regrettably, however, re-engineering of the TNT biosensor based on literature resulted in a strain not capable of reacting to TNT. In contrast, the re-engineered E. coli ribose biosensor was a sensitive sensor for ribose. Both RbsB and the TNT.R3 mutant protein were purified and ligand binding was studied by isothermal titration calorimetry. Whereas RbsB was binding ribose as expected, the TNT.R3 protein bound neither ribose nor TNT. We concluded that the published literature was incorrect as to the capacity of the TNT.R3 protein to bind TNT and E. coli expressing TNT.R3 to act as TNT biosensor. We further concluded that perhaps insufficient basic knowledge was available on the rôle of the différent amino acids in RbsB functioning.
In the second part of my work, I then focused on a more complété characterization of the rôle of the various amino acids on RbsB functioning. For this purpose an alanine scan of the complété protein was performed. Ail Ala-replacement mutants were expressed in E. co//'containingthe hybrid receptor and both inducibility by ribose as well as periplasmic abundance of (a selected set of) Ala-mutants compared to RbsB were studied. We found several inconspicuous mutations in RbsB, outside the immediate ribose binding région, strongly affecting its functionalities - either signaling only, or production, or both. Several mutations affecting RbsB functionalities had previously been targeted in the TNT.R3 mutant design. The extensive investigation led to findings such as the negative effect of the mutation D89A located in the cavity on the binding of the ribose molecule. In contrast, the mutation N190A situated close to D89 revealed no influence on the ribose binding but rather impaired the protein stability. We expect that our results will be bénéficiai for future renewed ligand- binding based on the scaffold of RbsB, and could improve the simulation algorithm and thus the accuracy of prédiction.
In the third part of my work, I focused on a new ligand-binding design starting with the wild-type RbsB to achieve incrémental gain of function with ribose-like substances, notably 1,3-cyclohexanediol (13CHD). Approximatively 2 million computationally predicted mutants were produced in the E. coli hybrid receptor background with enhanced green-fluorescent protein as reporter. The mutant library was screened for gain of induction by 13CHD and loss of induction by ribose using fluorescence- activated cell sorting (FACS). Surprisingly, the mutant production in RbsB led to a high number of constitutive EGFP-producing clones, which complicated séparation of potential RbsB mutants with true gain of function. Nevertheless, several mutants with loss of ribose inducibility but reacting to 13CHD with 1.3 times induction were obtained. RbsB itself does not react to 13CHD at ail. Thermodynamic calculations further suggest that it might be difficult to correctly predict more inducible mutants, which gain little in free energy of binding. These results will have to be reproduced independently, but suggest that it may be possible to change ligand-binding properties of periplasmic binding proteins by protein design.
Despite the potential for synthetic biology and protein design to obtain artificial ligand-binding for new biosensors, further understanding will be needed of the highly branched and complex networks of protein-protein-interactions and extensive efforts to generate empirical laboratory data will be required.
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Proteine sind Molekùle, welche an beinahe allen molekularen Prozessen eines Organismus' beteiligt sind. Sie katalysieren biochemische Reaktionen, leiten Signale weiter oder binden verschiedenste organische und anorganische Substanzen. Eine bedeutende Klasse der Substrat-bindenden Proteine (SBP) ist die Familie der periplasmatischen Bindeproteine (PBP). Diese vielseitige Proteinfamilie kommt in vielen Organismen vor und kann von Metallen ùber Zucker bis hin zu Peptiden verschiedenste Molekùle binden. Aufgrund dieser Eigenschaft waren sie schon Objekt vieler wissenschaftler Untersuchungen. Besondere Aufmerksamkeit bekam das Ribose bindende periplasmatische Protein RbsB des Escherichia coli. Dieses Protein ist an zwei Prozessen beteiligt. Zum einen bindet es Ribose, welches anschliessend ùber ABC-Transporter in das Zellinnere abgegeben wird. Und zum anderen, ist es Teil des sogenannten chemotaktischen Systems, welches Bakterien dazu befahigt Lockmittel wie z.B. Nàhrstoffe zu detektieren und auf sie zu zuschwimmen. 1994 ist es J. W. Baumgartner gelungen durch die Konstruktion eines Hybridrezeptors die Signalweiterleitung an die Expression eines Reporterproteins zu knupfen, anstelle des ursprunglichen Àndern des Schwimmverhaltens des Bakteriums. Somit konnte der modifizierte Bakterienstamm als Biosensor agieren, welcher auf eine steigende Ribosekonzentration mit einer erhôhten Fluoreszenz reagiert. Aufgegriffen und weiterentwickelt wurde diese Idee 2003 von L. L. Looger, welcher das Bindeprotein RbsB mithilfe von Computersimulationen neu designen konnte. Bei der in vitro als auch in vivo Uberprufung konnten die vorhergesagten Affinitàten der modifizierten Bindeproteine bestetigt werden. Von besonderem Interesse war fur uns der Mutant TNT.R3, welcher Trinitrotoluol (TNT) mit einer Affinitat von 2 nM binden konnte. Basierend auf den publizierten Ergebnissen haben wir versucht den Sensor nachzubauen, um ihn daraufhin weiterentwickeln zu kônnen. Bei der Rekonstruktion sind wir jedoch auf erhebliche Schwierigkeiten gestossen, hervorgerufen durch die Instabilitat des Mutanten. Basierend auf den erfolgreichen Ergebnissen der Kontrolproteine mussten wir feststellen, dass TNT.R3 nicht in der Lage ist TNT zu binden. Diese Ergebnisse wurden bereits von weiteren Forschungsgruppen bestatigt.
Hervorgerufen durch die unerwarteten Resultate, entwickelten wir zwei neue Strategien. Zum einen war ein Mangel an empirischen Daten beziiglich des RbsB-Proteins offensichtlich und zum anderen haben wir mit einer Neukonstruktion wieder bei RbsB angefangen und diese in kleinen Schritten durchgefûhrt angefangen bei Ribose ahnlichen Substanzen. Die erste Strategie enthielt einen Alaninscan des kompletten Proteins. Dazu werden aile Aminosauren des Proteins nacheinander durch Alanin ersetzt und der Einfluss der Modifizierung auf Expression, Stabilitàt und die Bindung von Ribose untersucht. Dabei ergaben sich einerseits offensichtliche Erkenntnisse wie der negative Effekt der Mutation D89A (einer Aminosaureposition welche sich in der Bindetasche befindet) auf die Bindung des Ribosemolekuls. Andererseits, hat die Mutation N190A (ebenfalls in der Bindetasche befindlich) keinen Einfluss auf die Bindung von Ribose, sondern vielmehr eine negative Auswirkung auf die Stabilitat des Proteins. Durch die enorme Anzahl empirischer Daten, welche durch den hier erwàhnten Alaninscan generiert wurden, werden zukunftige Designaufgaben basierend auf RbsB profitieren, da die Vorhersagegenauigkeit der Simulationsalgorithmen durch das Einspeisen der empirischen Labordaten signifikant zunehmen wird.
Die zweite Strategie betrifft, wie bereits erwahnt, den Wildtyp des RbsB-Proteins. Bei dieser Herangehensweise werden im ersten Schritt Ribose-ahnliche Zielmolekule wie z.B. 1,3- Cyclohexandiol (13CHD) genutzt. So sollen durch einige wenige Eingriffe die Stabilitat als auch die Produktion des modifizierten Proteins sichergestellt werden. Die Simulationen wurden mit den Programmen CHARMM und Rosetta durchgeftihrt. Anschliessend wurden ungefahr 2 Millionen Mutanten mit Hilfe der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) gefiltert. Dabei ergaben sich Schwierigkeiten durch falsch-positive Mutanten, welche selbst durch ein zyklisches Aufreinigungsverfahren nicht vollstàndig abgetrennt werden konnten. Schliesslich konnte ein Mutant identifiziert werden, der 13CHD um das 1,3-fache starker bindet als der nicht-modifizierte Wildtyp. Dieses Ergebnis zeigt zum einen das Potential der periplasmatischen Bindeproteine und zum anderen die Bedeutung eines guten Filtersystems.
Die hier vorliegende Doktorarbeit ist ein Meilenstein der Synthetischen Biologie. Synbio wurde wahrend der letzten Dekade zum Hype, konnte jedoch bis heute nicht zu einem richtigen Durchbruch kommen. Das liegt zum einen an der geringen Menge an empirischen Labordaten und zum anderen am fehlenden Verstandnis bezuglich der stark verzweigten und komplexen Netzwerke von Protein- Protein-lnteraktionen. Gerade an diesem Punkt setzt vorliegende Arbeit an und tragt so zu einer erfolgreichen Entwicklung von Synbio in naher Zukunft bei, wo mithilfe von in-silico-Vorhersagen Sensoren fur jegliche Art von Zielmolekûl hergestellt werden kônnen, sei es um Wasserverschmutzungen aufzuzeigen oder bei Raumarbeiten auf Minenfeldern Leben zu schutzen.