Huntington's disease (HD) is a fatal neurodegenerative disorder, caused by a dominant genetic mutation within the first exon of the huntingtin gene (HTT). HD patients go through a progressive and severe motor and cognitive decline, associated with the selective degeneration of striatal and cortical neurons in the brain. Currently, no curative treatment is available, and the pathology management is mainly focused on symptoms reduction. Among the therapeutic strategies under development, CRISPR/Cas9-mediated inactivation of the HTT gene represents a promising approach. However, most studies to date have focused exclusively on the treatment of the striatum with less regard to the involvement of cortical neurons in the HD pathogenesis.
ln the present project, we aim to improve this approach, by developing an innovative and powerful gene editing tool, to simultaneously target cortical and striatal projection neurons in the mouse brain, leading to consistent HTT inactivation in both cell types. In order to simplify the assessment of technical readouts in vivo, we took advantage of wild-type mice and a sgRNA targeting the mouse HTT to establish and characterize the system. We used CRISPR/Cas9 to selectively inactivate the mouse HTT by targeting a region close the translation start site of the gene, using either the spCas9 or the saCas9 nuclease variant. The latter, because of its small size, was used to develop a single AAV vector driving the expression of both the nuclease and the sgRNA, in order to potentially increase the efficiency of our approach, with ail transduced cells expressing both elements. A first, in vitro screening, demonstrated promising results using both systems. However, the dual vector spCas9 showed higher efficiency in vivo compared to the single vector saCas9 and was therefore selected for further studies. We combined the efficiency of the spCas9 gene editing system with the retrograde transport feature of the newly characterized AAV2-retro variant, and the broad local diffusion promoted by the AAV2/10 serotype, reaching consistent and simultaneous HTT inactivation in both striatal and cortical projection neurons within the mouse brain, following a single injection procedure. The efficiency of our system in vivo was confirmed by a substantial reduction of the HTT protein expression observed in the mouse striatum two month after the surgery.
Finally, we improved the biosafety of our approach by developing an optimized AAV version of the
self-inactivating KamiCas9 system previously described, showing transient Cas9 expression while maintaining high on-target efficiency both in vitro and in vivo.
Based on this promising results, our system represents an innovative and powerful tool for the future development of new and efficient genome editing therapeutic approaches for HD, potentially maximizing their therapeutic effect by promoting the simultaneous HTT inactivation in both striatal and cortical projection neurons within the brain.
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La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative mortelle, causée par une mutation génétique dominante dans le premier exon du gène huntingtin (HTT). Les patients atteints de la MH connaissent un déclin moteur et cognitif progressif et sévère, associé à la dégénérescence sélective des neurones striataux et corticaux du cerveau. Actuellement, aucun traitement curatif n'est disponible, et la prise en charge de la pathologie est principalement axée sur la réduction des symptômes. Parmi les stratégies thérapeutiques en cours de développement, l'inactivation du gène HTT par CRISPR/Cas9 représente une approche prometteuse. Cependant, la plupart des études menées jusqu'à présent se sont concentrées exclusivement sur le traitement du striatum, sans tenir compte de l'implication des neurones corticaux dans la pathogenèse de la MH.
Dans le présent projet, nous visons à améliorer cette approche, en développant un outil d'édition génétique innovant et puissant, pour cibler simultanément les neurones de projection corticaux et striataux dans le cerveau de la souris, conduisant à une inactivation HTT cohérente dans les deux types de cellules. Afin de simplifier l'évaluation des résultats techniques in vivo, nous avons utilisé des souris de type sauvage et un ARNg ciblant la HTT de la souris pour établir et caractériser le système. Nous avons utilisé CRISPR/Cas9 pour inactiver sélectivement la HTT de la souris en ciblant une région proche du site de début de traduction du gène, en utilisant la variante de nucléase spCas9 ou saCas9. Cette dernière, en raison de sa petite taille, a été utilisée pour développer un vecteur AAV unique permettant l'expression à la fois de la nucléase et du sgRNA, afin d'augmenter potentiellement l'efficacité de notre approche, toutes les cellules transduites exprimant les deux éléments. Un premier criblage in vitro a montré des résultats prometteurs en utilisant les deux systèmes. Cependant, le vecteur double spCas9 a montré une plus grande efficacité in vivo par rapport au vecteur simple saCas9 et a donc été sélectionné pour des études supplémentaires. Nous avons combiné l'efficacité du système d'édition de gènes spCas9 avec la caractéristique de transport rétrograde de la variante AAV2-retro nouvellement caractérisée, et la large diffusion locale favorisée par le sérotype AAV2/l 0, pour atteindre une inactivation cohérente et simultanée des HTT dans les neurones de projection striataux et corticaux du cerveau de la souris, après une seule procédure d'injection. L'efficacité de notre système in vivo a été confirmée par une réduction substantielle de l'expression de la protéine HTT observée dans le striatum de la souris deux mois après la chirurgie.
Enfin, nous avons amélioré la biosécurité de notre approche en développant une version AAV optimisée du système KamiCas9 auto-inactivant précédemment décrit, montrant une expression transitoire de Cas9 tout en maintenant une efficacité élevée sur la cible à la fois in vitro et in vivo.
Sur la base de ces résultats prometteurs, notre système représente un outil innovant et puissant pour le développement futur de nouvelles approches thérapeutiques efficaces d'édition du génome pour la MH, maximisant potentiellement leur effet thérapeutique en favorisant l'inactivation simultanée de la HTT dans les neurones de projection striataux et corticaux du cerveau.