Spleen and lymph nodes (LN) are compartmentalized into functionally distinct microenvironments, which are thought to optimize antigen presentation to naïve recirculating lymphocytes. These microenvironments are formed to a large extent by fibroblasts: Follicular Dendritic Cells (FDC) in the B cell follicles with the remaining fibroblasts being collectively termed Fibroblastic Reticular Cells (FRC). FRC have an important role in the architecture of these organs by their network organisation as well as their matrix production. But FRC are also the main cell type responsible for the compartmentalization of these organs into B and T cell rich-zones through production of chemokines. By these different aspects, FRC have a central role in the development of adaptive immune responses.
Gene array analysis of lymph node FRC showed expression of Notch receptors (Notch1, 2 and 3), RBP-J the main transcription factor of Notch signaling as well as Hes1 and Hey1 genes, well known target genes of this signaling pathway. Using flow cytometry, cell surface expression of Notch1 and Notch2 on naive LN FRC was confirmed. These findings suggested the presence of an active Notch signaling in LN FRC.
In this thesis work, I aimed to investigate the role of Notch signaling in FRC development and function. The Notch pathway is an evolutionary conserved signaling pathway important for cell fate decision and differentiation, as well as cell metabolism and survival. By genetic loss- of-function experiments, we have investigated the function of Notch1 and Notch2 genes selectively in CCL19Cre recombinase expressing fibroblasts, both during homeostasis and immune response.
Combined deletion of Notch1 and 2 affects the T zone FRCs in multiple ways, by altering the usually regular 3D network organisation, and by decreasing the extra-cellular matrix (ECM) and CCL19 production. Combined Notch1/2 deletion in FRC also affects neighbouring cells: While the general compartmentalization of lymph nodes is preserved, we observed a marked loss of T cells particularly in naïve mice, an altered B-cell follicle shape and an aberrant presence of lymphatic and blood vessels within the T-cell zone of pLN. Nevertheless, T cell responses developed relatively normally.
Single floxed mice analyses showed that Notch2 is the key receptor in the observed phenotypes found in combined knockout mice. Through the study of the specific deletion of RBP-J in CCL19cre+ FRC, we were able to conclude that the phenotypes observed upon Notch2 deletion were mainly RBP-dependent. Most of these phenotypes are already present in the early postnatal mouse life.
Based on these results, we postulate that active Notch signaling in FRC or their precursors does not seem to alter their differentiation into distinct FRC subset but is an important developmental regulator of FRC organisation and function, thereby impacting also on neighbouring hematopoietic and stromal cells. We hypothesized that modification of chemokine production but also possible modification of VEGF and podoplanin signalings in FRC with Notch1/2 deletion could be potential causes of neighbouring cell modifications.
Together, these findings will improve our understanding of fibroblast development, function and interaction with neighbouring hematopoietic and stromal cells which generate microenvironments that ultimate impact on adaptive immunity and thereby immune control of pathogens and tumours.
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La rate et les ganglions lymphatiques sont des organes lymphoïdes secondaires compartimentés en divers micro-environnements fonctionnels. L’architecture de ces organes est faite pour optimiser la présentation des antigènes ainsi que la circulation des lymphocytes naïfs. Ces microenvironnements sont en grande partie formés par des fibroblastes : les cellules dendritiques folliculaires (FDC) présentes dans les follicules et les autres fibroblastes nommés cellules fibroblastiques réticulaires (FRC). Ces FRC jouent un rôle primordial dans l’architecture de ces organes lymphoïdes secondaires par leur organisation en réseau 3D ainsi que par la production de matrice extra-cellulaire. Mais grâce à leur production de chimiokines, ces FRC sont aussi les acteurs principaux du cloisonnement de ces organes en deux types de régions, les régions riches en lymphocytes B et les régions riches en lymphocytes T (zone T). Grâce à ces différentes fonctions, les FRC occupent une place centrale dans le développement de la réponse immunitaire adaptative.
L’analyse par microarrays du transcriptome des FRC, provenant de ganglions lymphatiques naïfs de souris, a révélé l’expression des récepteurs Notch (Notch1,2 et 3), du facteur de transcription principal RBP-J de la voie de signalisation Notch ainsi que Hes1 et Hey1, deux principaux gènes cibles de cette voie de signalisation. L’analyse par cytométrie en flux des FRC, provenant de ganglions lymphatiques, a confirmé l’expression en surface de Notch1 et Notch2. Ces diverses données suggèrent une activation de la voie de signalisation Notch dans ces FRC. L’objectif de ce travail de thèse était d’examiner le rôle de la voie Notch dans le développement et les fonctions des FRC.
La voie de signalisation Notch est une cascade de signalisation conservée chez les métazoaires. Elle est fréquemment impliquée dans des choix de différenciations cellulaires, de métabolisme ainsi que dans la survie des cellules. Grâce à l’utilisation du système de recombinaison Cre-lox qui empêche la transcription des gènes Notch1 et Notch2 (récepteurs de la voie Notch), par excision sélective, dans les FRC exprimant CCL19, nous allons examiner quelles sont les fonctions de cette voie Notch dans les FRC dans l’homéostasie ou lors d’une réponse immunitaire.
La suppression de Notch1 et Notch2 affecte l’organisation 3D du réseau de FRC dans la zone T ainsi que la production de la matrice extra-cellulaire et de la chimiokine CCL19. En supprimant Notch1 et Notch2 dans les FRC, les autres cellules hématopoïétiques ou stromales, partageant leurs environnements sont aussi affectées.
Bien que l’organisation générale du ganglion soit préservée, la suppression de Notch1 et Notch2 entraine une remarquable diminution du nombre de cellules T, une structure modifiée des follicules et une présence aberrante de vaisseaux au sein de la zone T. Malgré ces altérations, la réponse immunitaire des lymphocytes T semble se dérouler normalement.
L’analyse des modèles génétiques de suppression de Notch1 ou Notch2 dans les FRC a démontré que Notch2 est le récepteur jouant le plus grand rôle dans les phénotypes précédemment observés. L’utilisation d’un autre modèle de suppression du gènes RBP-J dans les FRC nous permet de conclure que la plupart des phénotypes dus à la suppression de Notch2 sont aussi dépendant du facteur de transcription RBP-J. La plupart de ces phénotypes sont aussi présents chez de jeunes souris, âgées de trois semaines.
En s’appuyant sur ces divers résultats, nous pouvons conclure que la voie de signalisation Notch dans les FRC ou leurs précurseurs, est un important système de régulation de l’organisation des FRC ainsi que de leurs fonctions, qui régule indirectement les cellules avoisinantes. Plusieurs hypothèses ont été envisagées, comme la modification de la production de chimiokines ou la possible modification des facteurs vasculaire de croissance (système VEGFR/VEGF) et de la podoplanine dans les FRC, pour comprendre comment la suppression de Notch1/2 dans les FRC pourrait modifier les cellules avoisinantes.
Ces données vont permettre d’approfondir nos connaissances sur les fonctions des fibroblastes ainsi que leur interaction avec les cellules hématopoïétiques et stromales avoisinantes afin de générer un micro-environnement impactant la réponse immunitaire adaptative et ainsi le contrôle des pathogènes et des tumeurs.