Cancer immunotherapy has emerged as a promising therapeutic approach for cancer treatment, specifically through adoptive cell transfer (ACT), which involves the utilization of engineered tumor-specific T-cells. Gene therapy, involving modifying T-cells to express chimeric antigen receptors (CARs) or T-cell receptors (TCRs), holds significant potential for addressing the limitations of T-cell-based therapies for solid tumors. Ongoing research endeavors are dedicated to enhancing the specificity of engineered T-cells to effectively recognize tumor cells. Efforts are also focused on optimizing TCR activation and increasing overall antitumor activity to overcome the immunosuppressive tumor microenvironment (TME). Furthermore, diverse engineering strategies are being explored to mitigate the potential adverse effects associated with T-cell adoptive therapy, including TCR T-cell cross-reactivities, cytokine release syndrome, and on-target/off-tumor toxicities. The precise regulation of gene expression and the refinement of vector design play a pivotal role in advancing gene engineering approaches and ensuring their efficacy in clinical settings.
This thesis addresses the challenges associated with treating solid tumors by employing innovative combinatorial T-cell engineering strategies. The first part of the study introduces a novel lentiviral vector design incorporating two genes of interest, notably, an inducible or constitutive microRNA (miRNA) for instance, to induce a gene knockdown (KD) explicitly targeting hematopoietic progenitor kinase 1 (HPK1), which is an intracellular negative regulator of the TCR, in addition to a constitutive CAR targeting prostate- specific membrane antigen (PSMA) in prostate cancer or a TCR targeting New York esophageal squamous cell carcinoma 1 (NY-ESO1) which is a cancer-testis antigen expressed in various solid tumors, including melanoma and sarcoma. Furthermore, we have developed an optimized protocol for high-titer viral particle production to mediate efficient genetic modification in T-cells while ensuring its suitability for clinical translation. The second part of the thesis investigates a novel combinatorial approach that targets multiple negative regulators of TCR signaling, focusing primarily on HPK1 as the primary target while also considering other selected genes.
In this regard, we have conducted a comprehensive overview of various negative regulators within the TCR signaling pathway and identified the most relevant targets for our specific study. We have also investigated the impact of downregulating these genes on T-cell antitumor activity using a retroviral vector designed to incorporate single, dual, or multiple miRNAs for inducing single or concomitant perturbations downstream of the TCR pathway. After screening over twelve genes for their upregulation upon antigen stimulation, casitas B-lineage lymphoma b (Cbl-b) and neural precursor cell-expressed developmentally downregulated protein 4 (NEDD4), both belonging to the ubiquitin-protein ligases family, were selected for constitutive downregulation alongside HPK1. The impact of their downregulation on in vivo antitumor activity and in vitro cytotoxicity, proliferation, and cytokine secretion was assessed. While downregulating NEDD4 in addition to HPK1 KD or in combination with HPK1-Cbl-b KD did not yield significant advantageous outcomes, while the combination of HPK1-Cbl-b KD showed promising potential. It notably resulted in a significant delay in tumor growth in vivo and increased cytokine secretion in vitro upon antigen engagement. This work also revealed the advantages of high-affinity TCR T-cells over low-affinity TCR T-cells. It highlighted the importance of removing intracellular TCR checkpoints to enhance T-cell activation, particularly in high- affinity TCR. Furthermore, a clustered regularly interrupted short palindromic repeats (CRISPR) screening approach, utilizing a small TCR signaling library comprising twenty-seven negative regulators, along with positive and negative controls, underscored the necessity of adopting a combinatorial KD approach as individual negative regulator genes alone failed to improve T-cell persistence in vivo.
Taken together, this thesis contributes to the development of effective gene therapy strategies by addressing the challenges faced in T-cell-based immunotherapy through innovative combinatorial T-cell engineering approaches aiming to enhance the efficacy of treatments against solid tumors.
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L'immunothérapie du cancer s'est imposée comme une approche thérapeutique prometteuse pour le traitement du cancer, notamment par le transfert adoptif des cellules T génétiquement modifiées pour reconnaitre spécifiquement les cellules cancéreuses. La thérapie génique, qui consiste à modifier les cellules T pour qu'elles expriment des récepteurs d'antigènes chimériques (CAR) ou des récepteurs des cellules T (TCR), offre un potentiel significatif pour surmonter les limites des thérapies à base de cellules T contre les tumeurs solides. Des recherches en cours visent à améliorer la spécificité des lymphocytes T génétiquement modifiés pour une reconnaissance efficace des cellules tumorales. Les efforts sont également axés sur l'optimisation de l'activation des TCR et l'augmentation de l'activité antitumorale globale afin de surmonter les obstacles rencontrés dans le microenvironnement immunosuppresseur des tumeurs (TME). En outre, différentes stratégies de génie génétique sont explorées pour atténuer les effets indésirables potentiels liés à la thérapie adoptive des cellules T, tels que les réactions croisées des TCR, le syndrome de libération de cytokines et les toxicités ciblées ou non tumorales. La régulation précise de l'expression des gènes et le raffinement de la conception des vecteurs jouent un rôle crucial dans le développement des approches de génie génétique et dans la garantie de leur efficacité dans les contextes cliniques.
Cette thèse aborde les défis associés au traitement des tumeurs solides en utilisant des stratégies combinatoires novatrices de la modification génétique des cellules T. La première partie de l'étude présente une nouvelle conception de vecteur lentiviral incorporant deux gènes d'intérêt. Il s'agit notamment d’un microARN (miARN), par exemple, soit inductible ou constitutif pour l'inhibition génique ciblant spécifiquement la kinase 1 du progéniteur hématopoïétique (HPK1) comme étant un régulateur négatif intracellulaire du TCR, en plus d'un CAR constitutif ciblant l'antigène membranaire spécifique de la prostate (AMSP) du cancer de la prostate ou d'un TCR ciblant l’antigène NYESO1 (New York esophageal squamous cell carcinoma 1) qui est un antigène du cancer-testicule exprimé dans diverses tumeurs solides, y compris le mélanome et le sarcome. De plus, nous avons développé un protocole optimisé pour la production de particules virales à haut titre, permettant une modification génétique efficace des cellules T tout en garantissant son adaptation à l’utilisation clinique. La deuxième partie de la thèse explore une nouvelle approche combinatoire ciblant multiples régulateurs négatifs du signal TCR, en se focalisant principalement sur HPK1 en tant que cible principale, tout en considérant également d'autres gènes sélectionnés.
À cet égard, nous avons réalisé une revue complète des différents régulateurs négatifs de la voie de signalisation du TCR et avons identifié les cibles les plus pertinentes pour notre spécifique étude. Nous avons également étudié l'impact de l'inhibition de ces gènes sur l'activité antitumorale des cellules T en utilisant un vecteur rétroviral conçu pour incorporer un, deux ou plusieurs miARNs afin d'induire des perturbations individuels ou concomitantes en aval de la voie du TCR. Après avoir examiné plus de douze gènes pour leur expression lors de la stimulation antigénique, le lymphome à lignée B de casitas b (Cbl-b) et la protéine 4 régulée au cours du développement exprimée par les cellules précurseurs neuronales (NEDD4) qui appartiennent tous deux à la famille des ligases de l'ubiquitine, ont été sélectionnées pour une inhibition constitutive parallèlement à HPK1. L'impact de leur répression sur l'activité antitumorale in vivo, ainsi que sur la cytotoxicité, la prolifération et la sécrétion de cytokines in vitro, a été évalué. Bien que la répression de NEDD4 en plus de celle du HPK1 ou en combinaison avec l'inactivation de HPK1-Cbl-b n'ait pas conduit à des résultats significativement avantageux, il est important de souligner que la combinaison de HPK1-Cbl-b KD a montré un potentiel prometteur. Elle a notamment entraîné un retard significatif de la croissance tumorale in vivo et une augmentation de la sécrétion de cytokines in vitro lors de la stimulation antigénique. Cette étude a également mis en évidence les avantages des lymphocytes T à TCR à haute affinité par rapport à ceux à faible affinité, soulignant l'importance de l'élimination des points de contrôle intracellulaires du TCR pour renforcer l'activation des lymphocytes T, en particulier dans le cas des TCR à haute affinité.
De plus, une approche de criblage CRISPR (clustered regularly interrupted short palindromic repeats) utilisant une petite librairie comprenant vingt-sept régulateurs négatifs de signalisation du TCR a souligné la nécessité d'adopter une approche combinatoire d'inhibition, car l'inactivation individuelle des gènes régulateurs négatifs n'a pas amélioré la persistance des lymphocytes T in vivo.
Dans l'ensemble, cette thèse contribue au développement de stratégies efficaces de thérapie génique en s'attaquant aux défis rencontrés dans l'immunothérapie à base de lymphocytes T, en utilisant des approches innovantes et combinatoire de génie génétique visant à améliorer l'efficacité des traitements contre les tumeurs solides.
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Au cours des dernières décennies, une approche de traitement contre le cancer appelée immunothérapie a été développée, comprenant différentes stratégies visant à éliminer les cellules cancéreuses. L'une de ces stratégies est le transfert adoptif de lymphocytes T modifiés génétiquement, qui consiste à prélever des lymphocytes T du patient ou de donneurs sains et à les modifier en laboratoire pour qu'ils puissent reconnaître spécifiquement les tumeurs et les éliminer. Cela peut être réalisé en introduisant des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) ou des récepteurs de cellules T (TCR) dans les lymphocytes T. Bien que cette approche ait montré une efficacité significative dans le traitement de certains cancers du sang, elle est limitée pour les tumeurs solides en raison des obstacles présents dans le microenvironnement immunosuppresseur des tumeurs (TME).
Cette thèse propose des stratégies innovantes de modification génétique des lymphocytes T pour surmonter ces obstacles.
Dans la première partie de l'étude, un nouveau type de vecteur lentiviral est présenté étant un des moyens utilisés en génie génétique pour introduire du matériel génétique spécifique dans les cellules. Ce nouveau vecteur contient deux gènes d'intérêt. Le premier gène introduit un CAR, de manière constitutive, spécifique de l'antigène membranaire spécifique de la prostate (AMSP) pour cibler le cancer de la prostate, ou un TCR spécifique du NYESO1 (antigène du carcinome épidermoïde de l'œsophage de New York 1) exprimé dans diverses tumeurs solides. Le deuxième gène est, par exemple, un microARN (miARN) qui réduit l'expression d'un gène inhibiteur de l'activation des lymphocytes T. Ce gène peut être exprimé de manière constitutive ou induite pour éviter une suractivation indésirable des lymphocytes T dans le TME. De plus, un protocole optimisé de production de particules virales à haute concentration a été développé pour permettre une modification génétique efficace des lymphocytes T tout en garantissant son utilisation clinique.
La deuxième partie de la thèse explore de nouvelles approches combinatoires ciblant plusieurs régulateurs négatifs du signal TCR, en mettant l'accent sur la kinase des progéniteurs hématopoïétiques 1 (HPK1) en tant que cible principale. Après avoir identifié les cibles les plus pertinentes pour cette étude, les effets de l'inhibition de ces gènes sur l'activité antitumorale des lymphocytes T ont été étudiés en utilisant un vecteur rétroviral conçu pour introduire un, deux ou plusieurs miARNs.
Par conséquence, des perturbations individuelles ou concomitantes de la voie du TCR sont générées. L’examination de l'expression de plus de douze gènes lors de la stimulation antigénique a permis la sélection de deux gènes appartenant à la famille des ligases de l'ubiquitine, notamment le lymphome à lignée B de casitas b (Cbl-b) et le neural precursor cell-expressed developmentally downregulated protein 4 (NEDD4), pour une inhibition constitutive. La stratégie combinée d'inactivation de HPK1 et Cbl-b a montré des résultats prometteurs retardant significativement la croissance tumorale in vivo et augmentant la sécrétion de cytokines in vitro lors de la stimulation antigénique. De plus, une approche de criblage utilisant la technologie CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) et une librairie comprenant vingt-sept régulateurs négatifs de la signalisation du TCR a souligné la nécessité d'adopter une approche combinatoire d'inhibition, car l'inactivation individuelle de ces gènes n'a pas amélioré la persistance des lymphocytes T in vivo.
Dans l'ensemble, cette thèse contribue au développement de stratégies efficaces de thérapie génique pour les tumeurs solides en utilisant des approches innovantes de génie cellulaire combinatoire visant à améliorer l'efficacité des traitements contre ces types de cancer.