Résumé
Le canal épithélial sensible à l'amiloride, ENaC, est la cible principale de la régulation hormonale dans le rein, particulièrement pour l'insuline et les minéralocorticoides. ENaC est composé de trois sous-unités homologues, α, β et γ et est le facteur limitant du transport sodique au travers de l'épithelium serré du rein. ENaC est hautement exprimé dans la partie distale du néphron sensible à l'aldostérone (ASDN). ENaC est régulé par Sgk1, une kinase Ser/Thr, qui a été identifiée comme un gène de réponse précoce à l'aldostérone, son produit augmentant l'abondance d'ENaC à la surface cellulaire et aussi la probabilité d'ouverture du canal. L'insuline, qui n'affecte pas l'expression génétique de Sgk1, augmente l'activité de Sgk1 via phosphorylation de la kinase. Cependant, il a été suggéré que Sgk1 intègre les voies de régulation du transport sodique de l'insuline et des minéralocorticoides. Le mécanisme de la régulation de ENaC par l'aldostérone et Sgk1 n'est pas entièrement élucidé. Il pourrait impliquer Nedd4-2, une protéine ubiquitine ligase qui régule négativement ENaC en promouvant l'ubiquitylation et l'endocytose du canal.
Un motif riche en proline, le motif PY (xPPxY), se retrouve dans la partie C-terminale de chaque sous-unité de ENaC et permet l'interaction avec les domaines WW de Nedd4- 2. Des délétions et mutations du motif PY des sous-unités β et γ d'ENaC sont à l'origine du syndrome de Liddle, une maladie héréditaire caractérisée par une hypertension, une hypokaliémie et une alcalose métabolique. Nedd4-2, selon la forme épicée, contient deux à trois consensus de phosphorylation par Sgk1 (RxRxxS/T) ce qui indique que Nedd4-2 pourrait être une cible de Sgk1. Sgk1 lui-même contient un motif PY. Nous avons émis l'hypothèse que Sgk1 puisse interagir avec les domaines WW de Nedd4-2 via son motif d'interaction PY et réguler ENaC par la phosphorylation de Nedd4-2. Nous avons exploité le système d'expression de Xenopus laevis et montré que Sgk1 pourrait phosphoryler Nedd4-2 chez Xenopus, primairement sur la Ser444, mais aussi sur la Ser338. Cette phosphorylation dépend de l'activité catalytique de Sgk1 et de l'intégrité de son motif PY. Nos data amènent à l'évidence que Sgk1 contrôle l'expression d'ENaC à la surface cellulaire via la phosphorylation de la Ser444 de Nedd4-2. Finalement, nous montrons que la co-expression de Sgk1 avec ENaC et Nedd4-2 réduit l'interaction ENaC/Nedd4-2, ceci menant probablement à une diminution de l'ubiquitylation et de l'endocytose d'ENaC, ainsi qu'à une accumulation du canal à la membrane plasmique. Afin d’apporter une évidence supplémentaire de l'implication de la phosphorylation de Nedd4-2 dans l'action de l'aldosterone au niveau de l'ASDN, nous avons développé un anticorps spécifique contre Nedd4-2 phosphorylée en Ser328 chez la souris (équivalent à la Ser444 de Nedd4-2 chez Xenopus). En utilisant cet anticorps, nous observons dans une lignée cellulaire dérivée du tubule collecteur cortical de la souris que l'aldostérone augmente la phosphorylation de Nedd4-2 sur la Ser328. Cette augmentation est accompagnée par une expression induite de Sgk1 et une stimulation du transport sodique transépithélial. Cette réponse à l'aldostérone peut être prévenue par l'inhibiteur de la kinase PI-3, LY294002. Comme l'activation de Sgk1 dépend de la cascade de la kinase PI-3, ces data suggèrent que la phosphorylation de Nedd4-2 par Sgk1 participe à la réponse de l'aldostérone et par conséquence à la réabsorption sodique dans le rein.
Résumé large public
Dans les sociétés industrialisées, la surconsommation de sel (chlorure de sodium) favorise une augmentation de la pression artérielle et entraîne de nombreuses conséquences pour la santé. L'hypertension frappe 20% de la population; elle favorise l'infarctus, la congestion cérébrale, la thrombose et l'insuffisance rénale. En dépit de son importance comme cause de maladie, les mécanismes de l'hypertension ne sont toujours pas connus. Cependant, de nombreuses observations permettent d'affirmer que le canal épithélial au sodium (ENaC) joue un rôle important dans le maintien de la balance sodique. La découverte de modifications de ce canal dans une forme d'hypertension génétique rare (le syndrome de Liddle) montre que la fonction du canal ENaC est critique dans le contrôle de l'équilibre de la pression artérielle. ENaC se trouve à la surface cellulaire, à la membrane apicale de la partie terminale du nephron, l'unité fonctionnelle du rein, et est sous le contrôle de l'hormone aldostérone et de plusieurs autres facteurs. Il s'agit d'une protéine multimérique, composée de trois sous-unités homologues, α, β et γ. Chaque sous-unité contient dans sa partie intracellulaire un motif riche en l'acide aminé proline (P), le motif PY, qui est délété ou muté chez les patients souffrant du syndrome de Liddle. La protéine ubiquitine ligase Nedd4-2 est un répresseur de l'expression d'ENaC à la surface cellulaire; Nedd4-2 interagit avec ENaC via les motifs PY des sous- unités β et γ du canal. Lorsque la région d'interaction est mutée ou délétée, comme c'est le cas dans le syndrome de Liddle, le canal ne peut plus lier Nedd4-2 et s'accumule à la membrane cellulaire augmentant la réabsorption de sodium et par conséquence la pression artérielle.
Ce travail de thèse a consisté à étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation/expression d'ENaC par Nedd4-2. On a caractérisé le rôle de la kinase Sgk1 qui est induite par l'aldostérone. Dans les ovocytes de Xenopus, Sgk1 modifie (par phosphorylation) Nedd4-2 et diminue l'interaction d'ENaC avec Nedd4-2 promouvant ainsi l'accumulation du canal à la surface cellulaire. Dans une lignée cellulaire de tubules rénaux, on a également montré que l'aldostérone augmente le transport sodique, la phosphorylation de Nedd4-2 et l'expression de Sgk1. La connaissance détaillée de ce processus contribue à la caractérisation des éléments clés qui pourraient être utilisés dans le développement de médicaments spécifiques pour contrôler la tension artérielle