Plant roots have evolved to prevent diffusion between the soil and the vasculature in order to fulfill two opposing needls: to absorb water and nutrients; and to avoid that harmful agents reach the vasculature. In the endodermis, the tissue layer surrounding the root vasculature, cells form a précisé imprégnation of lignin in the cell wall called the Casparian strip (CS). The CS is a ring-like structure and seals the apoplast. In conséquence, plants rely on selective uptake mechanisms to absorb nutrients. To date, little is known about the molecular factors accounting for polymerization of lignin in the CS. Lignin polymerization involves single-electron oxidation of monolignols, i.e. the archetype of lignin monomers, and the growing lignin chain. In this way, monolignols can be coupled into lignin polymers. Class III PEROXIDASEs (PRXs) and LACCASES (LACs) are monolignol oxidases in plants. In this thesis I conducted a study to ascertain whether PRXs and LACs are involved in the lignification of the CS, using the model plant Arabidopsis thaliana. First, I determined that PRXs are essential to form CS. Plants carrying combined mutations on five CS-localized PRXs (four mutant alleles are T-DNA insertions and one is a single-nucleotide insertion) are devoid of CS and accumulate H2O2 in the cell wall domain where the CS normally forms. Surprisingly, absence of CS delayed the establishment of endodermis apoplastic block much more than in loss-of-function mutant plants of MYB36, a master regulator of CS formation. Secondly, we found that four LACs (1, 3, 5 and 13) are targeted to the médian domain of the endodermal cell wall, where the CS forms. Nonetheless, plants carrying combined mutations on five LACs, including the four cited above (four mutant alleles are T-DNA insertions and one is a single-nucleotide insertion), do not have any discernibje defects in the CS. I also studied the mobility dynamics of proteins residing in the CS by Fluorescent recovery after photobleaching (FRAP). I utilized plants expressing fluorescently tagged proteins of CASPARIAN STRIP MEMBRANE DOMAIN PROTEIN 1 (CASP1), PRX64 and LAC3, and found that they have very low mobility. This pattern is reminiscent of that of CASP1, which was previously shown to be immobile once established in the membrane domain underlying the CS, also called the Casparian strip domain (CSD). I hypothesize, that proteins residing in the CS and required for local lignin polymerization at the CS could form a complex, with CASPs as scaffold proteins. Finally, I also worked on the establishment of a protocol to analyze by mass spectrometry proteins associated to the CS. Although it was possible to obtain cell wall préparations where CASP1-GFP was preserved, there was contamination from nucleus and vacuole, even after several treatments to remove them.
In summary, in this thesis I reported that PRXs are essential, and not redundant with LACs, in the lignification of CS. In addition, the fact that four LACs localized to the cell wall domain where the CS is formed suggests their participation in local lignin polymerization in the CS. Moreover, my results lend further support to a model previously proposed to explain localized lignin déposition in the endodermis, whereby spatial confinement of PRXs to the proximity of proteins producing reactive oxygen species (ROS) leads to précisé localization of the CS.
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La racine des plantes a évolué de manière à prévenir la diffusion entre le sol et leur système vasculaire dans le but de satisfaire deux exigences opposées : absorber l'eau et les nutriments tout en évitant que des agents nocifs n'atteignent le système vasculaire. Dans l'endoderme, la couche tissulaire entourant le système vasculaire des racines, les cellules produisent une imprégnation particulière de lignine dans la paroi cellulaire que l'on appelle le Cadre de Caspary (CÇ).
Le CC est une structure en forme d'anneau qui scelle l'apoplaste. Par conséquent, les plantes dépendent de mécanismes sélectifs pour absorber les nutriments. A ce jour, très peu est connu sur les facteurs moléculaires qui déterminent la polymérisation de la lignine dans le CC. La polymérisation de la lignine implique une oxydation d'un seul électron des monolignols - qui constituent l'archétype des monomères de lignine - et de la chaîne croissante de lignine. De cette manière, les monolignols peuvent être accouplés pour constituer des polymères de lignine. Les peroxydases de classe III (PRXs) et les laccases (LACs] sont des enzymes capables de catalyser l'oxydation des monolignols.
Dans cette thèse, en utilisant la plante Arabidopsis thaliana comme modèle, j'ai mené une étude pour identifier si des PRXs et des LACs sont impliquées dans la lignification des CC. En premier lieu, j'ai déterminé que les PRX sont essentiels dans la formation des CC. Des plantes portant des mutations combinées sur 5 gènes codant des PRX localisées dans les CC sont dépourvues de cette structure et présentent une accumulation de H2O2 dans le domaine de la paroi cellulaire où se forme normalement le CC. De manière surprenante, l'absence de CC a retardé la mise en place de la barrière apoplastique dans la racine avec un impact beaucoup plus grand que ce que l'on constate avec des plantes mutantes privées de cette fonctionnalité par altération du gène MYB36, un des régulateurs principaux de la formation des CC. En second lieu, nous avons découvert que quatre LACs (1, 3, 5 et 13) sont dirigés à la zone de la paroi cellulaire où le CC est formé. Néanmoins, les plantes porteuses d'une mutation combinée de ces 4 LACs n'ont aucun défaut discernable dans le CC.
J'ai également étudié la dynamique de mobilité des protéines se trouvant dans le CC grâce à la technique appelé Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). En utilisant des plantes exprimant des protéines fluorescentes de CASPARIAN STRIP MEMBRANE DOMAIN PROTEIN (CASP1), PRX64 et LAC3, j'ai découvert qu'elles ont une très faible mobilité dans la paroi cellulaire, similairement à CASP1, une résidente de la membrane plasmique sous-jacent aux CC. Je formule l'hypothèse que les protéines se trouvant dans le CC et qui y sont nécessaires à la polymérisation de la lignine dans le CC pourraient former un complexe en se servant des protéines CASP comme point d'ancrage. En dernier lieu, j'ai travaillé à l'établissement d'un protocole pour analyser les protéines associées au CC. Il a été possible d'obtenir une préparation avec des parois cellulaires dans laquelle CASP1-GFP a été préservés. Cependant, malgré différents traitements d'extraction, les fractions isolées contenant CASP1-GFP étaient contaminées par des protéines d'autres compartiments cellulaires.
En résumé, je montre dans cette thèse que les PRXs sont essentielles, et ce sans redondance fonctionnelle avec les LACs, à la lignification des CC. De plus, le fait que quatre LACs aient été mis en évidence dans la zone de la paroi cellulaire où se forme le CC suggère qu'elles participent également à la polymérisation de lignine. Par ailleurs, mes résultats tendent à donner appui à un modèle proposé dans une étude précédente pour expliquer la formation localisée de lignine dans l'endoderme. Celui-ci prédit que le confinement spatial des PRXs dans la proximité de protéines produisant des dérivés réactifs de l'oxygène détermine la position précise des CC.
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Analyse des gènes codant des peroxydases et des laccases et de leur participation à la formation des cadres de Caspary
Nelson Rojas-Murcia, Département de Biologie Moléculaire Végétale (DBMV), Université de Lausanne
Les plantes terrestres absorbent l'eau et les nutriments du sol au travers de leurs racines. Mais, durant ce processus, les agents nocifs présents dans le sol ne doivent pas pouvoir entrer dans la plante. Ainsi, les tissus qui constituent les racines doivent satisfaire à ces deux exigences opposées. A cette fin, le tissu vasculaire qui transporte l'eau et les nutriments des racines jusqu'au reste de la plante sont entourés par l'endoderme. Les cellules de l'endoderme produisent dans leur paroi cellulaire des dépôts de lignine, un composant hydrophobe, formant un anneau autour de chaque cellule. Cet anneau s'appele le Cadre de Caspary (CC) et scelle l'espace entre cellules de l'endoderme. Toutes les CC de l'endoderme forment ensemble un réseau qui ressemble à un filet de pêche. En créant des CC, l'endoderme entrave le mouvement de substances entre le sol et le système vasculaire et les oblige à passer à travers des mécanismes sélectifs d'absorption dans les racines.
A ce jour, les facteurs contrôlant la formation de lignine dans les CC restent inconnus. La lignine est constituée par des chaînes de molécules s'appelant des monolignols et pour que la formation de ces chaines ait lieu, il est nécessaire que les monolignols soient oxydés. Des résultats de recherche dans d'autres tissus végétaux, notamment dans le bois où il y a une présence importante de lignine, indiquent que dans l'oxydation des monolignols participent deux groupes de protéines principalement: les peroxydases de classe III (PRX) et les laccases (LAC).
J'ai procédé à une étude génétique pour déterminer si les PRXs et les LACs sont impliqués dans la lignification des CC au moyen de la planté Arabidopsis thaliana. J'ai découvert que les PRX sont essentiels pour la formation des CC. En effet, lorsque cinq gènes codant des PRX logées dans les CC ont été désactivés, la plante n'a plus été capable de former des CC. Vu le rôle joué par les CC, la plante mutante présente des racines ayant des grands défauts de perméabilité.
J'ai également découvert que quatre gènes codant des LAC sont exprimés dans l'endoderme et produisent des protéines localisées dans le CC. Pourtant, la désactivation de ces quatre LAC n'a causé aucun changement apparent dans le CC. Malgré ce résultat, le fait que ces LACs puissent se retrouver dans l'espace précis occupé par la CC suggère qu'ils pourraient jouer un rôle clé dans la formation de lignine dans cet endroit de la paroi cellulaire. L'absence des défauts dans le CC après avoir désactivé 4 LACs pourrait être expliqué par la présence d'autres LACs encore actives dans le CC.
En résumé, les découvertes présentées dans cette thèse soulignent l'importance des PRX spatialement focalisés dans la formation des CC. Egalement, les résultats de cette thèse indiquent que des LACs pourraient aussi participer à la formation des CC. La localisation de PRXs et LACs spécifiquement dans la paroi cellulaire où se forme le CC indique que l'ensemble de facteurs impliqués dans la formation de cette structure est organisé de manière locale. Dans l'avenir il est important de continuer a investiguer le rôle des LACs dans la formation des CC, spécialement comment elles pourraient s'articuler avec des PRXs dans ce processus.