RESUME
La recherche concernant la régulation post-transcriptionnelle a pris du retard comparativement à celle de la régulation transcriptionnelle. Ceci est particulièrement vrai lorsque l'on pense aux signaux externes responsables de la stabilisation ou déstabilisation de l'ARN ainsi qu'aux facteurs "trans" qui sont encore mal connus, à l'exception de TTP, hnRNP D et HuR. Au contraire, plusieurs "cis"-éléments présents dans la séquence de l'ARN messager ont été caractérisés et parmi eux, les éléments riches en A et U (AU-rich element ---- ARE) sont reconnus comme étant les éléments déstabilisants les plus répandus. Les étapes de la dégradation de l'ARN messager sont bien connues dans la levure et apparaissent similaires dans les cellules mammifères. Dans plusieurs cas, la désadénylation est la première étape qui est suivie soit par l'élimination de la protection en 5’ (decapping) et la dégradation de l'ARN dans le sens 5’—>3,’ soit par la dégradation de l'ARN dans le sens 3’--->5’. Il n'est pas encore clair lesquelles de ces étapes sont accélérées par les AREs ou par d'autres éléments déstabilisants. Dans quelques cas, une coupure de l'ARN messager a été proposée comme l'étape initiale, comme pour l'ARN messager du récepteur de la transferrine par exemple. Toutefois, les enzymes impliquées dans la dégradation de l'ARN sont loin d'être connues et aucune enzyme responsable de la coupure de l'ARN messager (endoribonuclease) n'a été identifiée avec certitude
La première partie de ma thèse a pour but l'identification de nouveaux facteurs et enzymes. Dans ce projet, j'ai essayé d'isoler des cellules possédant des mutations les rendant incapable de dégrader rapidement l'ARN messager. J'ai exprimé la séquence codante de la GFP suivi par différents éléments déstabilisants provenant de la partie non-traduite des ARNs messagers des gènes humains du récepteur de la transferrine, de l'interleukine 6 (IL-6),GM-CSF, c-myc et c-fos. Ces deux derniers éléments n'ont pas rendu l'ARN messager de la GFP instable tandis qu'aucune lignée cellulaire adéquate exprimant GFP-GM-CSF n'a pu être isolée. Des mutations dans les lignées cellulaires exprimant GFP-IL-6 et GFP-GNRU (une version constitutivement déstabilisante de l'élément présent dans l'ARN messager du récepteur de la transferrine) ont été générées par deux différents agents chimiques puis les cellules mutantes ont été isolées par FACScan grâce à l'augmentation de la fluorescence.
Plusieurs mutants ont été isolés et caractérisés. Cette analyse a montré que ceux-ci avaient soit une dégradation de l'ARN messager non modifiée, soit des mutations "cis". Aucun mutant possédant une mutation "trans" n'a pu être isolé.
Dans la seconde partie de ma thèse, j'ai modifié soit par suppression partielle, soit par remplacement systématique, la partie non-traduite de l'IL-6 qui suit la partie codante de la GFP puis j'ai analysé la dégradation de l'ARN messager dans les lignées cellulaires COS7 et 3T3. J'ai défini deux régions déstabilisantes. La première de 15 pairs de bases appartient à la famille des AREs et possède la séquence AUUUA qui est conservée parmi les mammifères. La seconde de 45 pairs de bases ne présente aucune similarité avec d'autres éléments déstabilisants mais une structure en 'épingle a cheveux' dans cette région de l'ARN humain est conservée dans plusieurs espèces de mammifères. De plus, j'ai activé ou bloqué les voies de signalisation afin de déterminer lesquelles modulaient la dégradation rapide de l'ARN messager. J'en ai conclu que l'activation de la PKC ou de l'ERK stabilisent un ARN messager contenant la partie non traduite de l'IL-6. La voie de signalisation de PAMPK et de la phosphatase de l'inositol pourraient être impliquée tandis que la kinase p38, contrairement à notre attente, ne modifie pas la stabilité de l'ARN dans notre système. Parallèlement, j'ai montré la stabilisation de l'ARN de 1'IL-6 dans une lignée cellulaire isolée à partir d'un myélome multiple, ce qui indique l'implication de la stabilisation de l'ARN messager dans certains cancers.
Dans la troisième partie de ma thèse, j'ai préparé des vecteurs qui possèdent le gène néomycine pouvant être enlevé et qui sont nécessaires à la génération de souris n'exprimant plus, sous certaines conditions, les gènes hnRNP D ou HuR. Puis, j'ai déterminé les conditions de PCR requises pour trier les cellules ES ayant intégré le vecteur après électroporation. Ces souris devraient permettre de mieux comprendre le rôle in vivo de ces protéines et de déterminer quels sont les ARNs messagers cibles. Ce projet va être mené à terme par des collègues.
ABSTRACT
The first of 45 bases did not present any similarity to known destabilizing elements. A possible stem loop in this region of human IL-6 mRNA appears to be conserved in several mammalian species. The second of 15 bases belongs to the ARE family and possesses at least one conserved AUUUA pentamer. Furthermore, I induced or inhibited signaling pathways to determine whether they modulate rapid IL-6 mRNA decay. I conclude that activation of the PKC and ERK1/2 pathways stabilize an IL-6 3'UTR-containing mRNA. The AMPK and inositol phosphatase pathways may be involved but, contrary to our expectation, the p38 MAPK did not modify the mRNA stability in our system. Aside the IL-6 3'UTR analysis, I showed the stabilization of IL-6 mRNA in a human myeloma cell line, which indicates a possible role of mRNA stabilization in certain cancers.
In a third part of my thesis, I prepared the targeting vectors with a removable neomycin gene to generate conditional hnRNP D and HuR knockout mice. Then determined the PCR conditions to screen the ES cells electroporated with one of the targeting vector. These mice should shed light on the in vivo functions of these proteins and will help to determine their mRNA targets. Colleagues will bring this project to its end.