Acute myocardial infarction and heart failure represent major causes of morbidity and mortality worldwide. In humans and other mammals, heart régénération is extremely limited. In the damaged myocardium, cardiomyocytes (CMs) do not spontaneously re-enter the cell cycle to replace dead myocytes. The use of exogenous stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) in a cell replacement therapy or induction of cardiac régénération via stimulating cardiomyocyte division represent therefore attractive approaches. In this context, long non- coding (lnc)RNAs represent a new class of regulatory molecules that play important rôles in the control of cell identity and behavior. In the present study, we investigated the rôle of IncRNAs as regulators of ESC differentiation into CMs and of CM prolifération.
Our laboratory has previously shown that downregulation of the Notchl-receptor pathway favors differentiation of ESCs towards a cardiogenic fate. Interestingly, undifferentiated Notchl-deleted (Nldel) ESCs maintain a pluripotent state. Upon differentiation, however, Nldel ESCs produce increased amounts of cardiomyocytes. Long non-coding RNAs (IncRNAs) have emerged as important regulators of ESC pluripotency and differentiation. To characterize IncRNA transcriptome in undifferentiated and differentiated WT vs. Nldel ESCs, we performed deep RNA sequencing and ab initio transcript reconstruction. We identified many novel IncRNAs, which were differentially modulated in undifferentiated and differentiated ESCs between the two genotypes. We selected novel IncRNA candidates based on relative expression between WT and Nldel ESCs, and on their association with particular chromatin states. Two IncRNAs, named lnc007 and lnc9067, were shown to modulate cardiogenic differentiation in ESCs. In particular, lnc9067 appears to have an important rôle as a repressor of CM differentiation and maturation.
In a parallel study, we selected 350 IncRNA candidates from a catalogue of transcripts previously identifïed by our laboratory. We performed a high throughput screening assay (HTS) in vitro, using neonatal CMs, to measure the impact of individual IncRNA knockdown on CM prolifération and size. For this purpose, we generated a library of LNA Gapmers targeting each IncRNA. A number of Gapmer stimulated CM prolifération. The top 10 IncRNAs associated with CM prolifération upon knockdown were selected for further validation. Among these candidates, two IncRNAs were validated for further characterization. These IncRNAs, named Crimper and Clipper, were shown to be heart- and cardiomyocyte- enriched. Importantly, knockdown of Clipper in the infarcted heart induced CM prolifération. Clipper appears to function via modulation of its adjacent PCG, Lpinl, an important regulator of cardiac metabolism, mitochondrial biogenesis, and therefore of ROS production and DNA damage in CMs. Altogether, our study provides two proof-of-principle approaches to promote régénération in the damaged myocardium.
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L'infarctus aigu du myocarde et l'insuffisance cardiaque constituent les causes majeures de morbidité et de mortalité dans le monde. Chez l'homme et ainsi que chez d'autres mammifères, la régénération cardiaque est extrêmement limitée. Dans le myocarde endommagé, les cardiomyocytes (CMs) ne réintègrent plus spontanément le cycle cellulaire afin de remplacer les myocytes morts. L'utilisation de cellules souches exogènes, telles que les cellules souches embryonnaires (ESCs), dans une thérapie à replacement cellulaire ou l'induction de la régénération cardiaque via la stimulation de la prolifération des CMs constitueraient donc des approches thérapeutiques intéressantes. Dans ce contexte, les ARN longs non-codants (IncRNAs) représentent une nouvelle classe de molécules régulatrices jouant un rôle important dans le contrôle de l'identité et du comportement des cellules. Dans cette étude, nous avons voulu comprendre le rôle des IncRNAs en tant que régulateurs de la différenciation des ESCs en CMs et de la prolifération des CMs.
Notre laboratoire a précédemment montré que la régulation négative de la voie de signalisation du récepteur Notchl favorise la différenciation des ESCs vers un destin cardiogénique. Fait intéressant, les ESCs indifférenciées et délétères pour Notchl (Nldel) conservent un état pluripotent. Cependant, lors de la différenciation, les ESCs Nldel produisent une quantité accrue de cardiomyocytes. Les ARNs longs non-codants (IncRNAs) sont apparus comme d'importants régulateurs de la pluripotence et de la différenciation dans les ESCs. Afin de caractériser le transcriptome des IncRNAs dans les ESCs Nldel vs. WT indifférenciées et différenciées, nous avons effectué un séquençage d'ARN et une reconstruction du transcrit ab initio. Nous avons identifié de nombreux IncRNAs modulés dans les ESCs à l'état indifférenciées et différenciées entre les deux génotypes. Nous avons sélectionné des candidats IncRNAs en fonction de leur expression relative entre les deux types cellulaires ainsi que leur association avec des états particuliers de la chromatine. Nous avons démontré que deux IncRNAs, nommés lnc007 et lnc9067, modulaient la différenciation cardiogénique dans les
ESCs. En particulier, lnc9067 semble jouer un rôle important en tant que répresseur de la différenciation et de la maturation des CMs.
Dans une étude parallèle, nous avons sélectionné 350 candidats IncRNAs parmi un catalogue de transcrits précédemment identifié par notre laboratoire. Nous avons réalisé un criblage à haut débit (HTS) in vitro en utilisant des CMs néonataux afin de mesurer l'impact dû à la diminution d'expression de chaque IncRNA sur la prolifération et la taille des CMs. Pour ce faire, nous avons généré une bibliothèque de LNA Gapmers ciblant chaque IncRNA. Un certain nombre de Gapmer a stimulé la prolifération des CMs. Les 10 premiers IncRNAs montrant le meilleur taux de prolifération des CMs après utilisation des Gapmers ont étés sélectionnés pour une validation ultérieure. Parmi ces candidats, deux IncRNAs ont étés validés pour une caractérisation plus poussée. Ces IncRNAs, nommés Crimper et Clipper, se sont révélés être enrichis dans le cœur ainsi que dans les cardiomyocytes. De manière importante, la diminution d'expression de Clipper dans le cœur infarci induit la prolifération des CMs. Dès lors, Clipper semble fonctionner via la modulation de son gène adjacent, Lpinl, un important régulateur du métabolisme cardiaque, de la biogenèse mitochondriale et donc de la production de ROS et des dommages à l'ADN dans les CMs. En conclusion, notre étude démontre deux approches visant à promouvoir la régénération dans le myocarde endommagé.