Today, Alzheimer's disease (AD) is one of the most important age-related neurodegenerative diseases and of increasing prevalence. The causes of AD are not well understood. However, several hypotheses have been proposed to explain its pathogenesis, including oxidative stress which is increased with aging. Reports point to the implication of oxidative stress in AD. However, little information is available about the key time at which oxidative modifications start to affect protein expression and function and how it influences the appearance of AD and its progression.
In the present thesis project, the main aim was to determine early targets of oxidative stress that allow an understanding of the early affected pathways in the cell and how it enhances the progression of the disease. For this purpose, oxidized proteins in human autopsy frontal cortex tissues from mild and severe AD patients in addition to matched-control samples were analyzed. Proteins were studied by 1D and 2D electrophoresis, Coomassie blue and silver staining, Western blots and immunostaining for différent proteins of interest and also for post-translational modifications. In the first part, carbonylated proteins were detected by specific proteomic approaches and followed by their identification by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). In the second part, the oxidation of cysteine residues was measured by infrared dye labeling and 2D-fluorescent différence gel electrophoresis, followed by mass spectrometry (LC-MS/MS) for protein identification. In a third part, we addressed the question how protein expression and oxidation are affected by différent postmortem delays since many AD studies are using human autopsy brain tissues with différent postmortem delays. Experiments were done using mice frontal cortex tissues and différent proteomics techniques. Finally, we studied the conséquences of glutathione déficit on protein oxidation by using GCLM knockout mouse model and proteomics analyses. In addition, the effects of antioxidant treatment were also analyzed.
Following the analyses of carbonylated proteins and those with oxidized cysteine residues in AD and control samples, some selective proteins were found to be oxidized at mild stage of AD and before the détection of pathological tau accumulation in the frontal cortex. In addition, différent cell pathways were affected by oxidation. The majority of those proteins were involved in cytoskeleton structure, glucose metabolism and synaptic function. On the other hand, some proteins were found to be susceptible to dégradation with long postmortem delay (24 hours). However, long postmortem delay had less effect on protein oxidation and ubiquitination. Finally, glutathione déficit seemed to affect the oxidation levels of différent proteins and especially those involved in antioxidant defense mechanisms and ubiquitin proteasome system. In addition, antioxidant treatment had benefic effects on oxidative modifications of proteins.
Taken together, this study allowed the identification of key proteins that were affected by oxidative stress. These oxidative modifications disable protein repair and clearance, favor cell damage and aggravate neurodegeneration.
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La maladie d'Alzheimer (MA) représente la maladie la plus répandue parmi les maladies neurodégénératives qui sont liées à l'âge et dont sa prévalence continue à augmenté. Les causes de cette maladie ne sont pas encore bien comprises. En revanche, plusieurs hypothèses ont été suggérées dans le but d'expliquer la cause de cette maladie, parmi lesquelles le stress oxydative qui augmente bien avec l'âge. Cependant, peu d'informations sont connues sur le moment clé à partir duquel les modifications oxydatives commencent à affecter l'expression et la fonction des protéines et quand le stress oxydative induit l'apparition et la progression de la MA.
Dans mon projet de thèse, le principal but était de déterminer des cibles précoces du stress oxydative qui nous permettront de mieux comprendre les voies cellulaires qui sont touchées précocement dans la MA et qui favorisent sa progression. Dans ce but, des analyses des protéines oxydées ont été réalisées dans des autopsies humaines du cortex frontal isolées des vieux contrôles et des patients d'Alzheimer à un stade modéré et avancé de la maladie. Les protéines ont été étudiées par électrophorèse à une et deux dimensions, coloration par du bleu de Coomassie, coloration d'argent, Western blot et immuno-marquage des différentes protéines d'intérêts ainsi que de certaines modifications post traductionnelles. Dans une première partie, les protéines carbonylées ont été détectées par des approches protéomiques spécifiques et suivies par leur identification par la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS). Dans une deuxième partie, l'oxydation des groupes cystéines a été mesurée par un marquage fluorescent, analyses par 2D gels et suivie par leur identification par LC-MS/MS. Dans une troisième partie, nous avons abordé la question sur les impacts du long délai postmortem sur l'expression des protéines et leur taux d'oxydation en raison de l'utilisation des tissus humains avec des différents délais postmortem dans les études menées sur la MA. Les expériences ont été réalisées tout en utilisant des tissus du cortex frontal isolés des souris et des techniques protéomiques. Finalement, nous avons aussi étudié les conséquences d'un déficit du glutathionne sur l'oxydation des protéines en utilisant un modèle de souris knockout GCLM et des analyses protéomiques. En plus, les effets d'un traitement antioxydant ont été aussi investigués.
Suite aux analyses des protéines carbonylées et des groupes de cystéines oxydées dans des échantillons d'Alzheimer et des contrôles, certaines protéines sont apparues comme oxydées à un stade modéré de la MA et même avant l'accumulation des protéines pathologiques tau dans le cortex frontal. En plus, différentes voies cellulaires ont été touchées par l'oxydation. La majorité des protéines oxydées sont impliquées dans la structure du cytosquelette, le métabolisme du glucose et l'activité synaptique. En parallèle, certaines protéines ont été révélées comme susceptibles à la dégradation suite à un long délai postmortem (24 heures). Finalement, le déficit du glutathionne semblé affecter le taux d'oxydation de certaines protéines et surtout celui des protéines antioxydantes et des protéines liées au système de dégradation le protéasome. Ces modifications pouvaient être reversées par le traitement antioxydant.
Finalement, ces études ont aboutit à l'identification des protéines clés qui sont touchées par le stress oxydatif. Ces modifications oxydatives affecte la réparation et la dégradation des protéines touchées, favorise l'endommagement cellulaire et aggrave la neurodegenration.