La méthylation de l'ADN consiste en l'ajout d'un groupe méthyle par une méthyltransférase (MTase) sur des nucléotides dans des motifs spécifiques d'ADN. Chez les bactéries, la méthylation de l'ADN est impliquée dans divers processus cellulaires, notamment dans le contrôle de l'expression/l'évolution du génome ou en tant que systèmes immunitaires primitifs, bien que le(s) rôle(s) exact(s) de la plupart reste(nt) indéfini(s). Les MTases bactériennes font souvent partie des systèmes de Restriction­ Modification (RMs) : leur activité endonucléase de restriction (RE) coupe l'ADN non méthylé entrant provenant d'éléments génétiques mobiles (MGEs) ou de phages, tandis que l'ADN de l'hôte est protégé par son activité de méthylation. D'autres MTases sont orphelines, sans RE complémentaire. L'Alphaprotéobactérie et modèle de cycle cellulaire Caulobacter crescentus possède trois adénine MTases. L'une est une MTase orpheline et régulée par le cycle cellulaire (CcrM), tandis que les deux autres sont prédites comme faisant partie des RMS mais sont restées non caractérisées. L'objectif général de cette thèse était d'obtenir un aperçu complet de l'impact de la méthylation de l'adénine chez Caulobacter, par la caractérisation fonctionnelle de ses trois adénine MTases.
Le premier objectif était de comprendre comment, à travers des mécanismes de régulation épigénétiques, la méthylation par CcrM des motifs 5'-GANTC-3' peut contrôler l'expression des gènes, dans l'espoir d'identifier de nouveaux régulateurs transcriptionnels sensibles à la méthylation. Pour ce faire, nous avons d'abord sélectionné plusieurs promoteurs dépendants de CcrM et avons confirmé par une approche de génétique classique que leur régulation était bien dépendante de la méthylation. En cherchant des facteurs régulant ces promoteurs, nous avons émis l'hypothèse que le facteur de transcription StaR pourrait être un candidat intéressant. Cependant, les essais biochimiques qui ont suivi ont montré que StaR pouvait se lier à l'un des promoteurs sélectionnés et ce, indépendamment de son état de méthylation. Néanmoins, il reste tout de même possible que StaR puisse être sensible à la méthylation in vivo, notamment si d'autres protéines sont en compétition pour se fixer sur de tels promoteurs.
Le deuxième objectif était de caractériser la ou les fonction(s) moléculaire(s) et biologique(s) d'un potentiel RMS de type IIG présent chez Caulobacter. En retirant ce gène, et en caractérisant son méthylome ainsi que son transcriptome, nous avons découvert que cet RMS était bien responsable de la méthylation d'adénines présentes dans les motifs 5'-CGACCAG-3', mais qu'il n'avait pas d'impact sur l'expression des gènes de Caulobacter. En revanche, nous avons constaté que cet RMS réduisait
l'entrée d'un plasmide lors d'événements de transformation, ce qui est cohérent avec le fait que l'expression de cet RMS chez E. coli amenait à des effets délétères. Etonnamment, cet RMS-n'a pas eu d'impact lors d'infection par des bactériophages, ce qui le rend relativement atypique.
Le troisième but était de caractériser l'activité moléculaire et la régulation d'un putatif RMS de type I qui semble être co-exprimé avec une RE de type IV chez Caulobacter. Des expériences d'expression hétérologue chez E. co/i suggèrent que, pour avoir une activité efficace, RE I requiert son facteur de spécificité alors que RE IV serait dépendent de la MTase du RMS-1. De plus, des tests de stabilité ont indiqué que la MTase I et son facteur de spécificité étaient des protéines instables, probablement à cause de la présence de deux alanines dans leur région (-terminale. Etonnamment, nous avons aussi observé que RE IV colocalisait avec le divisome de Caulobacter lors de la réplication et avons imaginé un scénario dans lequel RE IV serait séquestrée pour éviter de nuire à Cau/obacter.
Dans l'ensemble, nos résultats démontrent que, chez Cau/obacter, la méthylation des adénines peut non seulement avoir un impact sur l'expression des gènes, mais aussi sur les mécanismes de transfert horizontaux de gènes. lis indiquent également que les protéases et la régulation spatiale peuvent jouer des rôles importants dans le contrôle du méthylome de Caulobacter, mettant en lumière l'impact et les mécanismes complexes que la méthylation de l'ADN peut avoir chez les Alphaprotéobactéries.
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DNA methylation consists in the addition of a methyl graup by a methyltransferase (MTase) onto nucleotides in specific DNA motifs. ln bacteria, DNA methylation is involved in a variety of cellular pracesses including contrai of genome expression/evolution or as primitive immune systems, although the exact role(s) of most remain(s) undefined. Bacterial MTases are often parts of Restriction­ Modification systems (RMs): its restriction endonuclease (RE) activity cuts incoming unmethylated DNA from mobile genetic elements (MGEs) or phages, while the hast DNA is pratected by its methylation activity. Other MTases are orphan ones, without a cognate RE. The Alphaproteobacterium and cell cycle model Caulobacter crescentus has three adenine MTases. One is an orphan and celi-cycle regulated MTase (CcrM), while the other two are predicted to be part of RMS but remained uncharacterized. The general goal of this thesis was to get a comprehensive overview of the impact of adenine methylation in Caulobacter, through the functional characterization of its three adenine MTases.
The first aim was to understand how S'-GANTC-3' methylation by CcrM can contrai gene expression through epigenetic mechanisms of regulation. We wished to identify navel methylation­ sensitive transcriptional regulators. ln order to do so, we first selected several CcrM-dependent promoters of interest and confirmed their methylation-dependent contrai using classical genetic approaches. Looking for factors regulating these promoters, we hypothesized that the StaR transcription factor may be a global epigenetic regulator. However, following biochemical assays showed that StaR can bind to one of the selected pramoters regardless of its methylation state. StaR may still be sensitive to methylation in vivo when other pratein partners are simultaneously recruited to such promoters during relatively complex epigenetic mechanisms.
The second aim was to characterize the molecular and biological function(s) of the predicted Type IIG RMs of Cau/obacter. We deleted the gene encoding this RMs and performed methylome and transcriptome analyses. These demonstrated that it methylates adenines in S'-CGACCAG-3'motifs but that it does not have an impact on gene expression. lnstead, we found that it reduces the entry of a selected plasmid by transformation, consistent with the observation that a heterologous expression of the RE part of this RMs appears as deleterious in E. coli celis. Surprisingly, it did not impact the infection of Cau/obacter by two different phages, suggesting the discovery of an atypical RMs.
The third aim was to characterize the molecular activity and the regulation of the predicted Type I RMs of Cau/obacter that appears as co-expressed with a Type IV RE. Heterologous expression assays in E. coli cells indicate that the Type I RE may need its associated Type I Specificity Unit (SU), while the Type IV RE may target DNA motifs methylated by the Type I MTase. Pratein stability assays showed that bath the Type I MTase and its associated SU are unstable proteins, most likely due ta two alanines found at their (-terminus, suggesting that methylation by the Type I MTase/SU may be subject to post-translational mechanisms of regulation. Strikingly, we also showed that the Type IV RE colocalizes with the Cau/obacter divisome at the septum. We hypothesize that this specific subcellular localization may sequester this potentially dangerous RE ta resolve an epigenetic conflict.
Overall, our results demonstrate that adenine methylation can not only impact gene expression but also horizontal gene transfer mechanisms in Cau/obacter. lt also indicates that proteases and spatial regulation may play important raies in contralling the overall methylomè of Caulobacter, shedding light on the regulation and the impact of DNA methylation in Alphaproteobacteria.