Abstract
The main thesis topic relates to the 'molecular mechanisms of penicillin-induced bacterial death. Indeed, bacteria have developed two principal mechanisms to escape the killing effect of ß-lactam antibiotics: resistance and tolerance.
Resistant bacteria are characterized by their ability to grow in the presence of drug concentrations higher than the one inhibiting the growth of susceptible members of the same species. Hence, resistant bacteria have an increased minimal inhibitory concentration (MIC) of the drug. Nevertheless, when exposed to antibiotic concentrations exceeding their new MIC, resistant bacteria remain sensitive to the antibiotic killing effect.
In contrast, tolerant bacteria have an unchanged MIC. However, they have a considerably increased ability to survive drug-induced killing, even at concentrations exceeding their MIC by several orders of magnitude. In other words, in the presence of the antibiotic, tolerant bacteria become persister cells which stop growing but are not killed.
In the present thesis, it is shown that the survival phenotype of a tolerant Streptococcus gordonii strain depends on two components belonging to sugar metabolism pathways.
First, the transcription factor CcpA which mediates a global regulatory mechanism allowing bacteria to utilize the most efficient sugar source for their growth. We show that the inactivation of the ccpA gene leads to a partial loss of penicillin tolerance both in vitro and in a rat model of experimental endocarditis.
Second, the Enzyme I of the phosphotransferase system which is involved in the uptake and phosphorylation of sugars. Here, we -show that a single nucleotide mutation in ptsI, the gene encoding the Enzyme I, is sufficient to confer a fully tolerant phenotype in S. gordonii both in vivo and in vivo. The mutation results in a radical proline to arginine substitution in the C-terminal domain of the protein, probably leading to a decrease in its homodimerization and subsequent activity.
Taken together our results prove that tolerance is a global survival mechanism linked to sugar metabolism. We hypothesize that, in the presence of the antibiotic, the already altered metabolic processes of the tolerant strain are completely inactivated. Hence, bacteria may enter in a dormant state and become insensitive to the bactericidal effect of ß-lactams, which depends on actively dividing cells.
This thesis manuscript also contains two other side-projects. The first one establishes that the ability to form a biofilm is not a requisite for the successful establishment of endocarditis due to S. gordonii. The second one characterizes the S. gordonii a-phosphoglucomutase gene, and shows that its inactivation results in a loss of in vitro fitness and in vivo virulence.
Résumé
Le sujet principal de cette thèse concerne les mécanismes moléculaires de la mort bactérienne induite par la pénicilline. En effet, les bactéries ont développé deux mécanismes principaux pour échapper à l'effet bactéricide des ß-lactamines : la résistance et la tolérance.
Les bactéries résistantes sont caractérisées par leur capacité de croître en présence de concentration d'antibiotiques plus élevées que celles inhibant la croissance des organismes sensibles de la même espèce. Les bactéries résistantes ont donc une augmentation de leur concentration minimale inhibitrice (CMI) à l'antibiotique. Néanmoins, quand elles sont exposées à des concentrations dépassant leur nouvelle CMI, elles restent sensibles à l'effet bactéricide.
Au contraire, les bactéries tolérantes ont une CMI inchangée. Toutefois, elles ont une très importante capacité à survivre à l'effet bactéricide des ß-lactamines, ceci même à des concentrations excédant leur CMI de plusieurs ordres de grandeur. En d'autres termes, en présence de l'antibiotique, les bactéries tolérantes deviennent des cellules persistantes qui arrêtent leur croissance mais ne sont pas tuées.
Dans la présente thèse, il est montré que le phénotype de survie d'un Streptococcus gordonii tolérant dépend de deux composants appartenant aux voies du métabolisme des sucres.
Premièrement, le facteur de transcription CcpA qui contrôle un système global de régulation permettant à la bactérie d'utiliser les sources de sucre les plus efficaces pour sa croissance. Il est montré que l'inactivation du gène ccpA résulte en la perte partielle de la tolérance à la pénicilline aussi bien in vitro que dans un modèle d'endocardite expérimentale chez le rat.
Deuxièmement, l'Enzyme I du système de phosphotransfert impliqué dans l'import et la phosphorylation des sucres. Nous montrons qu'une mutation ponctuelle d'un nucléotide dans ptsl, le gène codant pour l'Enzyme I, suffit à complètement conférer un phénotype tolérant chez S. gordonii aussi bien in vitro qu'in vivo. La mutation induit la substitution radicale d'une proline en une arginine dans le domaine C-terminal de la protéine, résultant probablement en une diminution de sa capacité d'homodimérisation et donc d'activité.
Dans leur ensemble, nos résultats prouvent que la tolérance est un mécanisme global de survie lié au métabolisme des sucres. Nous présentons l'hypothèse que, en présence de l'antibiotique, les processus métaboliques déjà altérés de la souche tolérante deviennent complètement inactifs. En conséquence, les bactéries entreraient dans un état dormant nonréplicatif, devenant ainsi insensibles à l'effet bactéricide des ß-lactamines qui nécessite des cellules en cours de division active.
Le manuscrit de cette thèse contient également deux projets secondaires. Le premier montre que la capacité de former un biofilm n'est pas un prérequis pour le succès de l'initiation de l'endocardite à S. gordonii. Le second caractérise le gène de l'a-phosphoglucomutase de S. gordonii et montre que son inactivation résulte en une perte de fitness in vitro et de virulence in vivo.