Radiotherapy (RT), is a powerful immuno-modulator and may potentiate or dampen the action of combined immunotherapies. To design synergistic combinations, the effect of RT on the tumor immune microenvironment (TIM) needs to be further studied.
We used the KrasLox-STOP-LOX-G12D/WT; p53Flox/Flox (KP) inducible model of lung ad- enocarcinoma that recapitulates the critical features of the human disease. We developed a method to analyze the TIM of isolated tumors. This analysis included a quantitative distri- bution of major immune cell types; their spatial distribution; and the kinetics of their re-
cruitment according to BrdU labelling. We studied RT-induced immunological changes at different timepoints after a single whole thorax irradiation at 11.7Gy.
We found tumor-associated-neutrophils (TANs) were highly prevalent within tu- mors, and spatially localized in-between tumor and blood vessels. Targeting TANs with an anti-Gr1 antibody, that recognizes both the Ly6G (specific for neutrophils) and Ly6C (also expressed on T cell subsets and the monocytic lineage) epitopes resulted in a 50% reduction in TANs count and a strong cytostatic effect on tumors. This treatment was associated with blood vessel normalization, reduced hypoxia and rendered tumors responsive to an anti- PD1 treatment, suggesting TANs are negative regulators of vessels and the CD8 mediated anti-tumor immunity. Yet, the more specific anti-Ly6G antibody did not reproduce this anti-tumor effect. As anti-Ly6G is more specific but less efficient than anti-Gr1 to deplete TANs, this difference of effect may either be due to the persistence of too many TANs, either to a necessary Ly6C+ co-target to impact tumor growth, or both.
Shortly after RT, TANs were over-represented in the tumor, while lymphocytes, mostly contained in radiosensitive Tertiary Lymphoid Structure (TLS), were transiently reduced. This imbalance may be caused by a direct exposure of TLS to RT, while neutro- phils coming from peripheral blood are less affected. To revert this imbalance, we com- bined the anti-Ly6G with RT. In this setting, the antibody induced a strong and long- lasting radio-sensitizing effect. BrdU-based experiments showed that anti-Ly6G antibody drastically enhanced TAN turn-over as we found a 400% increase of the young fraction of neutrophils. However, it also increased their speed of recruitment as the neutrophil count unexpectedly doubled 36 hours post anti-Ly6G + RT. We found TAN aging correlated with the tumor specific SiglecF differentiation, itself shown previously to correlate with PD-L1 expression. We conclude “keeping neutrophils young” enhances RT efficiency.
Altogether, our study shows TAN abnormal aging correlates with deleterious fea- es and reduction of RT efficacy. Limiting their lifespan may thus be sufficient to over- me this issue with no need to induce neutropenia, which is clinically much more feasible.
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La radiothérapie (RT) est un puissant immuno-modulateur et pourrait majorer ou diminuer l’effet d’immunothérapies combinées. Pour établir des co-traitements efficaces, l’impact de la RT sur le micro-envirronement tumoral (MET) doit donc être mieux compris.
Pour cela, nous avons utilisé un modèle de cancer pulmonaire KrasLox-STOP-LOX- G12D/WT; p53Flox/Flox (KP) qui reproduit la maladie chez l’Homme. Nous avons développé une méthode d’analyse du MET qui inclue une quantification des sous types immuns, leur distribution spatiale ainsi que leur cinétique d’infiltration tumorale. Nous avons ensuite étudié les changements du MET qui suivent une irradiation du thorax à 11,7Gy.
Nous avons trouvé que les neutrophiles infiltrants les tumeurs (NITs) sont une très prévalents et s’intercalent entre les cellules tumorales et les vaisseaux. Un traitement d’anticorps anti-Gr1, qui reconnait le Ly6G sur les neutrophiles mais aussi le Ly6C sur certains lymphocytes T et des cellules de la lignées myéloïdes, réduit par deux les NITs et la vitesse de pousse tumorale. Ce traitement est aussi associé à une meilleur perméabilité vasculaire, une réduction de l’hypoxie et rend les tumeurs KP sensibles à un traitement anti-PD1. Ceci suggère que les NITs sont impliqués dans la dérégulation vasculaire des tumeurs et qu’ils réduisent l’activité immunitaire anti-tumorale. En revanche, l’anticorps anti-Ly6G, plus spécifique que le Gr1 pour les NITs mais aussi moins efficace pour les supprimer, n’a pas reproduit l’effet anti-tumoral de l’anti-Gr1.
36h après la RT, les NITs sont surreprésentés dans la tumeur, tandis que les lymphocytes, principalement retenus dans des organes lymphoïdes tertiaires (OLT) en contact des tumeurs. Cette modification se normalise en deux semaines. Cette balance défavorable s’explique par les faits que les OLT sont sous le champ d’irradiation tandis que les neutrophiles viennent du sang, et sont donc moins exposés. Pour normaliser cette balance, nous avons co-traité les souris avec de l’anti-Ly6G avant une exposition de RT. Ce pré-traitement a drastiquement augmenté l’efficacité de la RT de façon durable, malgré une augmentation innatendue d’un facteur 2 du nombre de NITs. En utilisant le BrdU pour définir l’âge de ces NITs, nous avons montré que l’anti-Ly6G réduisait leur «espérance de vie » mais accélérait la vitesse de leur recrutement. Nous avons aussi montré que le vieillissement des NITs est nécessaire à l’acquisition du phénotype SiglecF, lui-même démontré être lié à l’expression de PD-L1. Nous concluons que « garder les neutrophiles jeunes » dans la tumeurs augmente l’efficacité de la RT.
Au final, notre étude montre que le vieillissement anormal des NITs corrèle à l’acquisition de propriétés limitant l’efficacité de la RT. Diminuer leur espérance de vie serait donc suffisant pour inverser ce problème, sans avoir à induire de neutropénie, ce qui est cliniquement beaucoup plus réalisable.
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D’après l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), il y a eu 2,09 millions de nouveaux cas de cancer du poumon diagnostiqués en 2018, pour 1,76 millions de décès. Pour les patients diagnostiqués à un stade précoce de la maladie, la radiothérapie a démontré son efficacité à visée curative. Pour les patients diagnostiqués à un stade avancé, qui représen- tent la majorité des patients, les immunothérapies, qui amplifient la réaction immunitaire anti-tumorale, semblent prometteuses, mais le taux de réponse relativement faible reste une limite à améliorer. La radiothérapie est un puissant modulateur du système immunitaire et pourrait donc avoir un effet synergique avec les immunothérapies. Mais pour maîtriser ces combinaisons de traitement, il est nécessaire de mieux caractériser les effets de la radio- thérapie sur le microenvironnement tumoral. Notamment, il faut comprendre la redistribu- tion des grands acteurs cellulaires après une irradiation qui pourrait avoir un effet positif ou négatif sur l’immunité anti-tumorale.
Pour étudier cette problématique, nous avons utilisé un modèle murin pré-clinique dont le processus tumoral est exclusivement déclenché dans le poumon par des modifica- tions génétiques fréquemment retrouvées chez les patients humains. Dans un premier temps, nous avons développé une méthode pour caractériser la signature immune de ces tumeurs. Puis nous avons appliqué cette méthode sur des tumeurs traitées par radiothérapie. Nous avons décrit une composante immunitaire tumorale complexe et mixte avec ;
d’une part des structures ressemblant à des ganglions à proximité immédiate des tumeurs, hautement prolifératives et que nous suspectons être une source importante des cellules effectrices de l’immunité anti-tumorale; et d’autre part une infiltration importante par des cellules provenant de la circulation sanguine, les neutrophiles, que nous suspectons être des cellules négativement régulatrices de l’immunité anti-tumorale.
Comme la radiothérapie est une modalité de traitement localisée, cette différence de provenance est importante. Nous avons en effet montré que les structures pseudo-gan- glionnaires qui sont dans le champ de traitement sont sévèrement endommagées par la radiothérapie mais se reconstituent dans un délai de deux semaines. Durant cet intervalle, les neutrophiles sont surreprésentés dans l’espace tumoral, car leur source, le sang, n’est quant à elle pas affectée par le traitement. Nous avons donc par la suite essayé d’inverser ce déséquilibre en utilisant des anticorps pour limiter l’influx de cellules régulatrices depuis le sang. Nous n’avons pas réussi à réduire le nombre de cellules régulatrices mais nous avons montré que réduire leur « espérance de vie » était suffisant pour augmenter l’effica- cité du traitement. D’après notre compréhension actuelle, le « vieillissement » cellulaire anormal intra-tumoral d’un certain sous type de cellules immunes aurait donc un effet délétère.