Recent sequencing efforts have identified millions of mutations in the human genome. However, the pathogenicity or functional consequence of >99% of these mutations remains unknown. Especially missense variants are hard to interpret as the effect of a mutation can range from having no impact to a complete loss of gene function. ln the first part of this thesis, we used CRISPR-Cas9 base editor screens to assess the effects of missense mutations on cell proliferation in a high-throughput manner. We performed a pooled CRISPR-Cas9 cytosine base editor screen targeting 100,000 different sites in 680 core essential genes that are required for viability across cell lines. We tracked the change in the abundance of mutants in cell pools over time under both standard conditions and conditions that affect protein stability. These latter conditions are expected to identify partial loss-of-function variants that are buffered under optimal proliferation conditions. Overall, we found that 24 % of missense alleles led to a proliferation defect in at least one of the tested conditions. Deleterious mutations tended to cluster together, highlighting functionally important residues, domains, and interaction interfaces. Sorne variants that were detected in patients but were of uncertain significance showed deleterious phenotypes in our screen, suggesting that they are pathogenic. Furthermore, some variants that we defined as deleterious were subsequently identified in patients with neurodevelopmental disease, highlighting the power of our dataset to characterize variant effects.
ln the second part of this thesis, we examined the effect of the genetic background on
the phenotypic outcome of a mutation. Modifying mutations can influence disease phenotypes and might compensate for the negative effect of deleterious mutations. ldentifying such suppressor mutations can improve our understanding of the mechanisms underlying human disease by revealing biological compensation mechanisms and may lead to the discovery of targets for new therapies. To understand the general principles of genetic suppression, we examined 2,400 published papers for potential suppressor interactions, considering both association studies in patients and studies using genetic modification of cultured cells. We found 476 suppression interactions of 93 deleterious "query" genes. The query-suppressor pairs often functioned in the same biological process. Additionally, suppression involved general compensation mechanisms, such as changes in signaling or stress responses. Suppressor variants were also often deleterious in the absence of the query gene, despite their protective nature in the presence of the query. Overall, we could mechanistically explain around 71% of the suppression interactions. Finally, we used the identified properties of suppression to build a prediction tool that can accurately find suppressor candidates for -50% of genetic diseases. To identify suppressor genes for the remaining disease genes, we developed an experimental method that makes use of CRISPR-Cas9 genome-wide knockout screens to identify genes that when knocked out can rescue the inducible fitness defect of conditional mutants. ln summary, we identified genetic suppression principles that are consistent across diseases, model systems, and species.
Overall, our results may contribute to the interpretation of genomic variants detected in patients, and provide guidelines for the development of predictive models of variant effects. The new knowledge gathered in this project has the potential to narrow down the search for suppressors in patients, uncover the molecular basis of diseases, and possibly highlight new paths for treatment strategies.
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Les récentes avancées des techniques de séquençage ont permis d'identifier des millions de mutations dans le génome humain. Cependant, la pathogénicité ou les conséquences fonctionnelles de plus de 99 % de ces mutations restent inconnues. En particulier, les mutations faux-sens sont difficiles à interpréter car leur effet peut aller de l'absence d'impact à une perte totale de la fonction du gène. Dans la première partie de cette thèse, nous avons utilisé des cribles à haut-débit d'éditeurs de bases CRISPR-Cas9 pour évaluer les effets des mutations faux-sens sur la prolifération cellulaire. Nous avons effectué un criblage d'éditeurs de bases de cytosine CRISPR-Cas9 en ciblant 100000 sites différents dans 680 gènes essentiels qui sont nécessaires à la viabilité dans toutes les lignées cellulaires. Nous avons suivi l'évolution de l'abondance des mutants dans la population de cellules au fil du temps, à la fois dans des conditions standards et dans des conditions qui affectent la stabilité des protéines. Ces dernières devraient permettre d'identifier des variants de perte partielle de fonction qui ne sont pas observables dans des conditions de prolifération optimale. Au total, 24 % des allèles faux-sens entraînaient un défaut de prolifération dans au moins une des conditions testées. Les mutations délétères ont tendance à se retrouver au même endroit, ce qui met en évidence des résidus, des domaines et des interfaces d'interaction importants sur le plan fonctionnel. Certains variants de signification incertaine détectés chez des patients ont présenté des phénotypes délétères lors de notre sélection, ce qui suggère qu'ils sont pathogènes. En outre, certains variants que nous avons définis comme délétères ont été identifiés par la suite chez des patients atteints de maladies neurodéveloppementales, ce qui souligne la puissance de nos données pour caractériser les effets des variants.
Nous avons ensuite examiné l'effet du fond génétique sur la conséquence
phénotypique d'une mutation. Les mutations modificatrices peuvent influencer les phénotypes des maladies et compenser l'effet négatif des mutations délétères. L'identification de ces mutations suppressives peut améliorer notre compréhension des mécanismes sous-jacents aux maladies humaines en révélant des mécanismes de compensation biologique et peut conduire à la découverte de cibles pour de nouvelles thérapies. Pour comprendre tes principes généraux de la suppression génétique, nous avons examiné 2400 articles afin de trouver des interactions suppressives potentielles, en tenant compte à la fois des études d'association chez les patients et des études réalisées en culture cellulaire. Nous avons trouvé 476 interactions de suppression pour 93 gènes délétères de référence. Les paires gène de référence-suppresseur fonctionnaient souvent dans le même processus biologique. En outre, la suppression impliquait des mécanismes de compensation généraux, tels que des modifications de la signalisation ou des réponses au stress. Les suppresseurs étaient également souvent délétères en l'absence du gène de référence, malgré leur caractère protecteur en présence du gène de référence. Dans l'ensemble, nous avons pu expliquer mécanistiquement environ 71 % des interactions de suppression. Enfin, nous avons utilisé les propriétés identifiées pour construire un outil de prédiction qui peut trouver avec précision des candidats suppresseurs pour environ 50 % des maladies génétiques. Pour identifier les gènes suppresseurs des gènes pathologiques restants, nous avons mis au point une méthode expérimentale qui utilise les cribles CRISPR-Cas9 à l'échelle du génome pour identifier les gènes qui, lorsqu'ils sont supprimés, peuvent remédier au défaut de prolifération des mutants conditionnels. En résumé, nous avons identifié des principes de suppression génétique qui sont cohérents entre les maladies, les organismes modèles et les espèces.
Dans l'ensemble, nos résultats peuvent contribuer à l'interprétation des variants génomiques détectées chez les patients et fournir des lignes directrices pour le développement de modèles prédictifs des effets de ces variants. Les nouvelles connaissances acquises dans le cadre de ce projet pourraient permettre de réduire la recherche de suppresseurs chez les patients, de découvrir les bases moléculaires des maladies et, éventuellement, de mettre en évidence de nouvelles stratégies thérapeutiques.