With increasing industrialization and the increasing amount of chemical compounds produced every day, the need of a proper monitoring of the environment is crucial. The use of biosensors based on living microorganisms is an interesting alternative to common chemical analysis. Since microorganisms are easy and cheap to produce, and thanks to their small size, they can be implemented in miniaturized portable devices, which may be used directly in the field. Common whole-cell bacterial bioreporters produce an easy detectable signal by induction of expression of a reporter protein in presence of either a specific molecule or a general stress reaction. Whole-cell bioreporter analysis is robust, but requires a couple of hours to obtain a clear reporter signal.
In this thesis, we envisioned to develop bacterial biosensors based on a different physiological response than de novo gene expression that could lead to a faster response time while keeping target sensitivity and specificity. In particular, we tried to exploit chemotaxis, the behaviour of motile bacteria to sense their environment and swim in the direction of or away from chemical compounds. Chemotaxis is rapid (sec–min scale) and some species show naturally chemotaxis towards compounds of environmental interest.
In Chapter 2, we quantified bacterial chemotaxis from direct measurements of cellular motility. We developed a microfluidic chip, which generated a stable attractant gradient and into which motile bacteria could be added. The bacteria sensed the chemical gradient and accumulated where the concentration of attractant is highest. Accumulation of cells was quantified over time by epifluorescence microscopy. As a proof of concept, we used chemotaxis of Escherichia coli towards serine, aspartate and methylaspartate. Notably, E. coli accumulated to 10 µM serine within 10 minutes, but showed maximum accumulation to 100 µM serine after 20 minutes or longer. Secondly, we quantified chemotaxis of Cupriavidus pinatubonensis JMP134 to 2,4-dichlorophenoxyacetate, a commonly used herbicide. Unfortunately, accumulation of JMP134 was not very sensitive and could only be observed with 1 mM 2,4- dichlorophenoxyacetic acid or higher. Steady-state chemodynamic and chemotaxis modelling was used to support the observed cellular response in the microfluidic chip as a function of attractant concentration.
In Chapter 3, we wanted to facilitate the manipulation of the microfluidic chip by the development of a different chip that integrates valves inside the structure. This could facilitate the control of the liquid flow inside the chip, as well as enable sample exchange. By focusing on individual cell movement, we expected we might achieve very short response times upon addition of attractants. The gradient was generated by alternating valve opening and motile E. coli were inserted in the middle of this pre-established gradient. Individual cell trajectories were monitored in the few first minutes of response. Contrary to our expectations, no significant difference in trajectory characteristics was measured in presence compared to absence of a gradient. Mathematical simulations of single cell chemotaxis response suggested that more time is required to observe cell accumulation, or that cells would have to be introduced closer to the source.
In Chapter 4, I focused on chemotaxis responses at the molecular and single cell level by measuring CheY–CheZ interactions. I fused two non-fluorescent parts of the green fluorescent protein (Gfp) to CheY and CheZ, components of chemotaxis pathway. I could demonstrate that Gfp fluorescent foci appear in single cells as a genuine interaction between CheY and CheZ. By mutant analysis, I showed that foci form mostly at the motor complex and less frequently at the sites of chemoreceptors. Not completely unexpected, the reformed split-Gfp was relatively stable and little dynamics in position or fluorescent intensity of foci was detected. However, single cell analysis indicated that the turnover of split-Gfp is more important immediately after addition of 100 µM nickel as repellent.
In Chapter 5, I attempted to measure chemotaxis response through pH changes at single cell levels. Notably, the flagellar motor is powered by an influx of protons through the cytoplasmic membrane. I deployed the pH-sensitive fluorescent protein pHluorin, either expressed inside the cytoplasm or in the periplasm of E. coli, to measure pH differences in chemotactically active cells. For this, I used a modified agarose-block test as attractant and recorded fluorescent changes in accumulating cells. Interestingly, a 100 µM serine source induced an increase of pH in the cytoplasm and a decrease in the periplasm in cells close to the source, but not in cells further away. This suggests an active export of protons from the cytoplasm to the periplasm during chemotaxis in order to compensate for the increased flux needed for the flagellar motors.
Finally in chapter 6, I attempted to change E. coli chemotaxis specificity by introducing receptors coming from Pseudomonas putida. I focused on two P. putida receptors, one for benzoate and the other for toluene. I demonstrated expression of both receptors in E. coli – although we cannot be completely certain that the proteins inserted into the membrane. Agarose-block tests with serine, toluene and benzoate, in comparison to no attractants, showed that E. coli cell accumulation close to a source of toluene was significantly higher in strains expressing the toluene receptor. E. coli without benzoate receptor accumulated as well as those with benzoate receptor near sources with benzoate.
In this work, we investigated different approaches to exploit chemotaxis in order to produce biosensing signals. Our results are promising and show that functional biosensors based on chemotaxis may be achieved in a variety of ways.
--
En raison de l’avancée de l’industrialisation et de l’augmentation du nombre et de la quantité de composés chimiques produits chaque jour, la surveillance de la pollution touchant notre environnement est cruciale. L’utilisation de biosenseurs basés sur des micro-organismes vivants est une alternative intéressante aux analyses chimiques couramment utilisées. Ces micro-organismes sont faciles et peu coûteux à produire et, grâce à leur petite taille, ils peuvent être facilement implémentés dans des appareils miniaturisés et portables pouvant être utilisés directement sur le terrain. Les biorapporteurs bactériens usuels produisent un signal facilement détectable conséquence de l’induction de l’expression d’une protéine rapportrice en présence d’une molécule spécifique ou en réponse à un stress. Les biorapporteurs sont des outils d’analyse robustes mais requièrent quelques heures pour obtenir un signal clair.
Dans cette thèse, nous avons eu pour but de développer des biosenseurs bactériens basés sur une autre réponse physiologique que l’expression de novo de gènes, ceci dans le but de produire une réponse plus rapide tout en conservant la sensibilité et la spécificité pour la molécule cible. En particulier, nous avons exploité le chimiotactisme, soit le comportement des bactéries mobiles qui peuvent sentir leur environnement et se déplacer pour s’approcher ou s’éloigner de composés chimiques. Le chimiotactisme présente l’avantage de fournir une réponse rapide, prenant de quelques secondes à quelques minutes. De plus, certaines espèces bactériennes sont connues pour montrer naturellement une attraction pour des composées d’intérêt environnemental comme des polluants.
Dans le chapitre 2, nous avons quantifié le chimiotactisme bactérien par mesure directe de la mobilité cellulaire. Nous avons développé une puce micro-fluidique qui génère un gradient stable d’attractant dans lequel des bactéries mobiles peuvent être ajoutées. Les bactéries sentent le gradient chimique et s’accumulent là où la concentration d’attractant est la plus élevée. Cette accumulation de cellules est quantifiée au cours du temps par microscopie à épifluorescence. Comme preuve de concept, nous avons utilisé le chimiotactisme d’Escherichia coli vers la sérine, l’aspartate et le méthylaspartate. E. coli est attiré par 10 µM de sérine en 10 minutes, mais montre une accumulation maximale avec 100 µM de sérine après au moins 20 minutes. Nous avons également quantifié le chimiotactisme de Cupriavidus pinatubonensis JMP134 pour le 2,4- dichlorophenoxyacetate, un herbicide communément utilisé. Malheureusement JMP134 n’était pas très sensible et la réponse n’a pu être observée qu’avec un minimum de 1 mM de 2,4- dichlorophenoxyacetate. La modélisation mathématique du chimiotactisme en fonction de la concentration d’attractant a été utilisée pour appuyer les résultats obtenus expérimentalement en utilisant la puce micro-fluidique.
Dans le chapitre 3, nous avons voulu faciliter la manipulation de la puce micro-fluidique en développant un autre type de puce qui intègre des valves à l’intérieure de leur structure. Cela facilite le contrôle du flux de liquide dans la puce, et permet ainsi un potentiel échange d’échantillons. En se focalisant sur le mouvement de cellules individuelles, nous nous attendions à obtenir un temps de réponse plus court après l’ajout d’attractant. Le gradient d’attractant est généré par des ouvertures alternées des valves et des cellules d’E. coli sont ensuite insérées au milieu du gradient préétabli. Les trajectoires de cellules individuelles sont enregistrées pendant les premières minutes de réponse. Contrairement à nos attentes, aucune différence significative dans les caractéristiques des trajectoires n’a été mesurée en présence ou en absence de gradient. Des simulations mathématiques de la réponse chimiotactique de cellules individuelles suggère la nécessitée d’un plus long temps d’observation ou encore d’introduire les cellules plus proche de la source d’attractant.
Dans le chapitre 4, nous nous sommes focalisés sur le chimiotactisme aux niveaux cellulaire et moléculaire en mesurant l’interaction entre deux acteurs de la signalisation. Pour cela, deux parties non-fluorescentes de la protéine fluorescente verte (GFP) ont été fusionnées aux protéines CheY et CheZ, composants de la signalisation du chimiotactisme. J’ai pu démontré que les foci de fluorescence apparaissant dans les cellules individuelles montrent l’interaction entre CheY et CheZ. Par l’analyse de mutants, j’ai montré que les foci se forment principalement au niveau du moteur des flagelles et moins fréquemment au niveau des récepteurs. La GFP reformée lors de l’interaction de CheY et CheZ est relativement stable et se révèle peu dynamique dans la position ou dans l’intensité de fluorescence des foci. Néanmoins, l’analyse des cellules individuelles indique que le turnover de la GFP est plus important immédiatement après ajout de 100 µM de nickel, utilisé comme substance répulsive.
Dans le chapitre 5, j’ai mesuré la réponse chimiotactique à travers les changements de pH au niveau des cellules individuelles. Le moteur des flagelles est énergisé par un influx de protons à travers la membrane cytoplasmique. J’ai donc exprimé une protéine fluorescente sensible au pH, la pHluorin, soit dans le cytoplasme ou le périplasme d’E. coli et mesuré les différences de pH dans des cellules actives pour le chimiotactisme. Pour cela, j’ai utilisé un bloc d’agarose contenant la source d’attractant et mesuré les changements de fluorescence des cellules attirées. Une source de 100 µM de serine induit une augmentation du pH dans le cytoplasme et inversement, une diminution dans le périplasme dans les cellules proches de la source mais pas dans les cellules plus éloignées. Cela suggère un export actif de protons depuis le cytoplasme dans le périplasme pendant le chimiotactisme afin de compenser l’augmentation de l’influx de protons nécessaire à la rotation des flagelles.
Finalement dans le chapitre 6, j’ai changé la spécificité du chimiotactisme d’E. coli en y introduisant des récepteurs venant de Pseudomonas putida. Je me suis intéressée à deux récepteurs de P. putida, l’un liant le benzoate et l’autre le toluène. J’ai démontré que l’expression des deux récepteurs se fait de façon correcte chez E. coli, même si l’on ne peut pas être complétement certain que les protéines soient correctement repliées ou encore bien insérées dans la membrane. Les tests par bloc d’agarose contenant la sérine, le toluène ou le benzoate en comparant à l’absence d’attractant, montrent que l’accumulation d’E. coli proche de la source est significativement plus important pour la souche exprimant le récepteur pour le toluène. D’autre part, la souche n’exprimant pas le récepteur au benzoate s’accumule aussi bien que la souche avec récepteur autour d’une source de benzoate.
Dans ce travail, nous avons investigué différentes approches pour exploiter le chimiotactisme dans le but de produire des signaux par des biosenseurs bactériens. Nos résultats sont prometteurs et montrent que des biosenseurs fonctionnels basés sur le chimiotactisme peuvent être obtenu par différentes approches.