Chemicals are crucially important for society, economy and prosperity. However, an uncontrolled release into the environment would be detrimental for human health and environment. Although they can be dispersed in the environment through various channels such as waterways, soils or the food chain, there is inadequate information available aboutthe environmental and health impacts of trace organic chemicals. One of the legislative actions to address environmental and health risks of chemicals is The European Legislation on Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals (REACH), which extended the coverage of chemicals since 2007. REACH emphasizes the availability of information on biodegradability of chemicals in water, aquatic sediment and soil for their hazard, chemical safety and persistence assessment. lnternationally acceptable guidelines to test biodegradability of organic chemicals for regulatory purposes are led by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). Other existing standards for biodegradability of organic chemicals, namely, from the European committee for standardization (CEN), the lnternational Organization for Standardization (lSO) and the American Society for Testing and Materials (ASTM) are based on the OECD guidelines. ln principle, activated sludge, sewage effluent, surface water or soil extracts can be used as inoculum sources for readily biodegradation screening tests (RBTs). The test substance.is dosed in concentrations of between 2 and 100 mg C l-1 as a sole carbon source. Subsequently, dissolved organic carbon, dissolved oxygen, carbon dioxide formation, oxygen consumption and inorganic carbon are monitored for 28 days to assess the compound's biodegradability. However, at concentrations where the test compound is toxic, the microbial activity may be inhibited, resulting in an underestimation of the compound's biodegradation potential. As a consequence, a biodegradable compound may become falsely classified as persistent. Also, replicate variability in RBTs tends to be large with high failure rates hampering their reliability. There is thus an urgent need to improve assessment of the biodegradation potential of microbial communities, which takes compound toxicity into account. Such an improvement might be achieved by optimal usage of flow cytometry, which allows fast and easy quantification of microbial cell numbers in suspension. Growth of natural bacterial communities may thus more reliably detected in response to dosed compounds to be tested for biodegradation. Assays with natural communities further have the advantages of including "uncultivable" members
and testing under environmental conditions. The main aim of this thesis was thus to develop, test and validate a flow cytometry method that allows rapid quantification of cell numbers in microbial communities, estimation of their net productivity at the expense of dosed compounds, and assessment of potential compound effects on the community composition.
ln the first chapter, we developed a deep-learning tool to recognize microbial cell variability from multiparametric flow cytometry (FCM) data. The idea behind our approach was to infer cell types (sizes and shapes) in microbial communities by comparing to sets of well-defined standard cell and bead classes. This was done by training an artificial neural network on collected multivariate FCM data sets of known cell types, and then using the resulting classifier to quantify.and predict class attribution of the same strains in unknown mixtures or of entirely unknown communities. We found that our tool reliably, fast, accurately and automatically classifies cells in samples of known cell mixtures or of natural unknown microbial communities into the corresponding classes. Even though classes were initially arbitrarily defined from a set of pure cultures and beads, we showed that variation in unknown microbial communities can be reliably interpreted using the classifier. Furthermore, the probability of class attribution of unknown cells can be described as a similarity score compared to the true class standard. As an example, we followed and quantified enrichment of phenol and L-octanol-degrading populations from lake water. Given known volumes and calculated masses from the cell and bead standards, classification of unknown communities into known cell classes leads to quantification of corresponding biomass changes of the entire community or subpopulations of it. This biomass formation can then be used to deduce biodegradation yields. We compared such estimated summed biomass in phenol- and L-octanol enrichments to an experimentally determined community biomass from lac-labeled compound incorporation, our found good results. We concluded that our tool can be used for net biomass productivity measurements of biodegradation tests. ln addition, the deep-learning tool can be an interesting and fast complementary approach for routine quantification of target strains within known or unknown microbial communities. ln the second chapter, we tested and validated the flow cytometry approach to assess microbial community and biomass growth at the expense of dosed compounds. ln particular, we aimed to test the reproducibility to measure increases in cell numbers at the expense of added single carbon substrates, the effect of compound concentration and the effects of different starting cell numbers. As inoculum source we used microbial communities from lake Geneva. We first established the method on a set of known reference compounds in biodegradation studies: benzoate, phenol and Loctanol; and then tested three fragrances with poorer biodegradability. Community growth
measurements were combined with chemical analyses of dosed parent compound, with COz formation as an indicator for mineralization, and with toc-labeled compound incorporation. Of tested carbon substrate concentrations between 0.L mg l-1 and 1g l-1 we found a method of detection limit il for net community growth at 100 pg f1. At lower concentrations, no net community growth is reliably detected as a result of background assimilable organic carbon in the medium. Different starting cell densities (between LOa and L06 cells ml-1) did not have a greatly different outcome, although we found increased possibility for background growth with25% included dead cell biomass.
Classification of community changes upon compound incubation was used to estimate net biomass formation, which was in excellent agreement with chemical transformation data and with toc-label incorporation. Net community growth was also observed in lake water community incubations with the three fragrances, but both chemical analytical measurements and net biomass projections indicated maximally 10% biodegradation within 4-10 days. Our results thus showed that the method is a reliable alternative to test compound biodegradability at carbon substrate concentrations anging between 0.1 and L0 mg C l-1with an initial community density of 10s cells ml-l. The results in this thesis contributed to development of improved methodology to rapidly detect compositional changes in target strains in known or unknown microbial communities, and to better estimate net biomass formation from biodegradation of targeted compounds. The combination of quantifying both community cell numbers and a degree of community diversity makes the method powerful for addressing a wide variety of effect-studies; compound biodegradation, but also toxicity or pharmaceutica I effects.
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Les produits chimiques ont une importance cruciale pour la société, l'économie et la prospérité. Toutefois, un rejet non contrôlé dans l'environnement pourrait nuire à la santé humaine et à l'environnement. Bien qu'ils puissent se disperser dans l'environnement à travers différents canaux, tels que les voies fluviales, le sol ou la chaîne alimentaire, nous ne disposons pas de suffisamment d'informations concernant les impacts sur l'environnement et la santé des produits chimiques organiques à l'état de trace. Une des actions législatives pour aborder les risques environnementaux et sanitaires des produits chimiques est l'Enregistrement, évaluation et autorisation des produits chimiques de l'Europe (The European Legislation on Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals - REACH) qui vise à couvrir les produits chimiques depuis 2007, REACH fait ressortir les informations disponibles sur la biodégradabilité des produits chimiques dans l'eau, les sédiments aquatiques et le sol à l'égard de leurs dangers, de la,sécurité chimique et de l'évaluation de la persistance. L'Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) donne des directives internationales acceptables pour tester la biodégradabilité de produits chimiques à des fins de réglementation. D'autres standards existants relatifs à la biodégradabilité de produits chimiques, notamment du Comité européen de normalisation (CEN), de l'Organisation internationale de normalisation (lSO) et de l'American Society for Testing and Materials (ASTM) sont basés sur les directives de I'OCDE. En principe, il est possible d'utiliserde la boue activée, un effluent d'eaux usées, de l'eau de surface ou des extraits de sol comme source d'inoculum pour réaliser des tests sur la biodégradabilité. La substance à tester est dosée dans des concentrations entre 2 et L00 mg C -1 comine seule source de carbone. Ensuite, le carbone organique dissous, l'oxygène dissous, la formation de dioxyde de carbone, la consommation d'oxygène et le carbone inorganique sont surveillés pendant 28 jours pour évaluer la biodégradabilité du composé. Néanmoins, à des concentrations auxquelles le composé testé est toxique, l'activité microbienne peut être inhibée, entraînant ainsi une sous-estimation du potentiel de biodégradabilité du composé. Par conséquent, un composé biodégradable pourrait être faussement classifié comme persistant. En outre, la variabilité de reproduction des tests sur la biodégradabilité est souvent élevée, avec d'importants taux d'erreur nuisant à leur fiabilité. ll est ainsi urgent d'améliorer l'évaluation du potentiel de biodégradation des communautés microbiennes en tenant compte de la toxicité des composés. Une telle optimisation nécessite une utilisation optimale de la cytométrie de flux, qui permet une quantification rapide et simple des nombres de cellules microbiennes en suspension. La croissance de communautés naturelles de bactéries peut ainsi être détectée de manière plus fiable en réponse à des composés devant être testés pour la biodégradation. Les analyses avec des communautés
naturelles ont également les avantages d'inclure des membres (( non cultivables > et des tests dans des conditions environnementales. L'objectif de cette étude était de développer, tester et valider une méthode de cytométrie de flux permettant une quantification rapide des cellules dans les communautés microbiennes, une estimation de leur productivité nette au détriment des composés dosés et une évaluation des effets potentiels de composé sur la composition des communautés. Dans le premier chapitre, nous avons développé un outil d'apprentissage en profondeur pour reconnaître les données de variabilité des cellules microbiennes de la cytométrie de flux multiparamétrique. L'idée derrière notre approche était de déduire des types de cellules (tailles et formes) dans les communautés bactériennes en les comparant à des ensembles de cellules standard bien définis et classes de billes. Ceci a pu être réalisé en formant un réseau neuronal artificiel sur des ensembles de données de cytométrie de flux multiparamétrique multivariées collectées de types de données cellules connus et à l'aide du clossificoteur obtenu pour quantifier et prédire l'attribution des classes des mêmes souches dans des mélanges inconnus ou des communautés entièrement
inconnues. Nous avons constaté que notre outil classifie les cellules de manière fiable, rapide, précise et automatique dans les échantillons de mélanges de cellules connues ou de communautés microbiennes naturelles inconnues dans les classes correspondantes. Bien que les classes étaient initialement définies de manière arbitraire depuis un ensemble de"cultures et billes pures, nous avons démontré que les variations dans les communautés microbiennes inconnues peuvent être interprétées de manière fiable à l'aide du classificateur. En outre, la probabilité d'attribution de classe des cellules inconnues peut être considérée comme une valeur de similitude comparée au véritable standard de classe. Pour illustrer, nous avons suivi et quantifié I'enrichissement en phénol et en octan-L-ol des populations dégradant I'eau des lacs. Étant donné les volumes connus et les masses calculées de standards de cellules et de billes, la classification des communautés inconnues dans les classes de cellules connues permet la quantification des changements de biomasse correspondants de l'ensemble de la communauté ou des sous-populations de celle-ci. Cette formation de biomasse peut ensuite servir à déduire les rendements de biodégradation. Nous avons comparé cette somme de biomasse estimée dans des enrichissements en phénol et en octan-l-ol à une biomasse de communauté déterminée expérimentalement à partir de l'intégration d'uncomposé marqué 1aC et obtenu de bons résultats. Nous avons déduit que notre outil peut être utilisé pour mesurer la prgductivité nette de la biomasse lors des tests de biodégradation. En outre, l'outil d'apprentissage en profondeur peut représenter une approche complémentaire intéressante et rapide pour la quantification de routine de souches cibles au sein de communautés microbiennes connues ou inconnues. Dans le deuxième chapitre, nous avons testé et validé l'approche de cytométrie de flux pour évaluer la communauté microbienne et la croissance de la biomasse au détriment des composés dosés. Nous avons notamment cherché à tester la reproductibilité pour mesurer l'augmentation du nombre de cellules au détriment des substrats de carbone uniques ajoutés, l'effet de la concentration des
composés et les effets des différents nombres de cellules de départ, Nous avons utilisé des communautés microbiennes du lac Léman comme source d'inoculum., Nous avons tout d'abord établi la méthode sur un ensemble de composés de référence connus dans les études sur la biodégradation : benzoate, phénol et octan-L-ol. Ensuite, nous avons testé trois fragrances avec une biodégradabilité inférieure. Des mesures de croissance des communautés ont été combinées avec des analyses chimiques de composés parents dosés, avec la formation de COz comme indicateur de minéralisation et avec une intégration de composé marqué 1aC. À partir des concentrations de substrats de carbone testées entre 0.1 mg l-1 et L gl-t, nous avons découvert Ia limite de détection pour la croissance de communauté nette de L00 Fg Tt.À des concentrations plus faibles, aucune croissance nette de communauté n'est détectée de manière fiable en raison du carbone organique assimilable de fond dans le milieu. Des densités de cellules de départ différentes (entre 10a et 106 cellules ml-1) n'ont pas présenté un résultat très différent, bien que nous avons constaté une possibilité accrue de croissance de fond avec 25 % incluant la biomasse des cellules mortes. La
classification des changements de communauté lors de I'incubation des composés a été utilisée pour estimer la formation nette de biomasse, qui était tout à fait en accord avec les données de transformation chimique et avec I'incorporation du marquage toc. Une croissance nette de la communauté a également été observée dans les incubations des communautés d'eau des lacs avec les trois fragrances, mais les mesures analytiques chimiques et les projections de la biomasse nette ont indiqué une biodégradation maximale de I0% en 4 à L0 jours. Nos résultats ont ainsidémontré que la méthode est une alternative fiable pour tester la biodégradabilité des composés à des concentrations de substrat de carbone comprises entre 0,L et L0 mg C l-1 avec une densité de communauté initiale de LOs cellules ml-1. Les résultats de cette thèse ont contribué au développement d'une meilleure méthodologie pour
détecter rapidement les changements de composition des souches cibles dans des communautés microbiennes connues ou inconnues à une meilleure estimation de la formation nette de biomasse à partir de la biodégradation des composés ciblés. La combinaison de la quantification du nombre de cellules communautaires et d'un certain degré de diversité des communautés rend la méthode adaptée pour traiter une multitude d'études d'effets. Non seulement la biodégradation des composés, mais aussi la toxicité ou les effets pharmaceutiques.