Background: CD8+ cytotoxic T cells play a pivotal role in the generation of cellular adaptive immune responses against intracellular pathogens and malignancies. The key event in triggering antigen-specific CD8+ T cell responses is the recognition by T cell receptors (TCR) of short antigenic peptides presented by major histocompatibility complex class-I (pMHC-I) molecules on the surface of infected or tumor cells. The strength of this recognition (i.e. TCR affinity/avidity) is one of the major parameters impacting on the magnitude of CD8+ T cell responses. Self/tumor-specific CD8+ T cells exist in cancer patients, yet these are mostly defined with relatively low TCR affinities and accordingly protection from tumor progression remains infrequent. Therefore, adoptive transfer of genetically modified CD8+ T cells expressing affinity- improved TCRs against tumor antigens represents a promising strategy to augment anti-tumoral responses. However, enhancing TCR affinity also brings along the risk of increased off-target toxicities, and thus, it is important to improve our knowledge about the fine-tuning of the TCR affinity-optimized CD8+ T cell responses.
Rational & Objectives: To investigate the impact of TCR affinity on T cell biological responses, our lab previously generated a panel of affinity-improved TCRs against the HLA-A2-restricted cancer-testis antigen NY-ESO-1. Using this panel, the existence of an optimal TCR affinity window lying at the upper physiological limits and associated with maximal CD8+ T cell functionality has been shown. Interestingly, further increase of TCR affinity beyond this window (defined as supraphysiological TCRs thereafter) resulted in drastic T cell functional impairment, related to the progressive upregulation of the inhibitory receptor PD-1. However, little remains known about the TCR affinity-mediated signaling characteristics underlying this optimal T cell activation and functionality as well as the regulatory mechanisms involved in controlling T cell responsiveness according to TCR affinity. Lastly, we aimed at investigating whether chronic interactions occurring between increased affinity TCR and MHC-(self) molecules could directly modulate the overall functional potency of tumor-redirected CD8+ T cells.
Methodology: In this thesis, we used phospho-flow and Western blot techniques to assess the expression and the phosphorylation levels of key TCR signaling molecules. We utilized multi-color flow cytometry to quantify expression levels of T cell surface markers. We relied on CRISPR/Cas9 technology to knock-out proteins of interest to study their role in TCR affinity-mediated signaling regulation.
Results:
Project 1: We first investigated the TCR affinity-mediated signaling characteristics underlying optimal T cell responses, as well as the dependency of this signaling to the antigen dose. We showed that CD8+ T cells expressing optimal affinity TCRs displayed the highest and most sustained activation levels at both the proximal CD3ζ and the distal ERK1/2 nodes of TCR signaling, irrespectively of the antigen dose. Conversely, in supraphysiological TCR bearing T cells, signal initiation was strong, yet poorly sustained, resulting in inefficient ERK1/2 activation even at the highest antigen dose. In parallel, under steady-state conditions, we observed significantly reduced surface TCR/CD3 complex and co-receptor expression levels in these cells (Presotto, Erdes et al Front Immunol., 2017). Together, these findings highlighted that the activation potential of CD8+ T cells bearing supraphysiological affinity TCRs might readily be inhibited by robust negative regulatory mechanism(s) even in the absence of cognate peptide stimulation. We defined this affinity-associated tolerance- like phenotype as the “hyporesponsive state”.
Project 2: By taking a candidate-based approach, we next assessed the contribution of several regulatory mechanisms that could possibly restrict the activation of supraphysiological CD8+ T cells. We found that SHP-1 activity negatively regulates TCR signaling at both proximal CD3ζ and distal ERK1/2 nodes, mostly acting on CD8+ T cells of supraphysiological affinity TCRs. In contrast, SHP-2 played a more global positive role on the distal node, without affecting proximal TCR signaling. These findings indicate that optimal TCR signaling can be finely tuned by TCR affinity-dependent SHP-1 and SHP-2 activity (Presotto, Erdes et al., Front. Immunol., 2017). We propose that these TCR affinity-associated regulations may represent potential protective mechanisms preventing high affinity TCR-mediated autoimmune diseases.
Project 3: Finally, we investigated the molecular reasons triggering the induction of this affinity-associated hyporesponsiveness of tumor-redirected T cells in the absence of cognate antigen. We hypothesized that chronic interactions between the supraphysiological TCRs and the HLA-A2 molecule itself could cause the activation of these cells and lead to the development of an hyporesponsive state. Under unstimulated, resting conditions, we found that de novo HLA-A2 expression in very high affinity T cells initially triggered the upregulation of co-activation/inhibitory markers (e.g. CD69 and PD-1), followed by TCR/CD3 downmodulation. In parallel, these cells also upregulated CD5 and c-Cbl expression, two negative regulatory molecules known to play important roles in TCR/CD3 complex downmodulation (Duong, Erdes et al., manuscript in revision). Our observations indicate that sustained interactions between affinity-increased TCR and self-MHC directly adjust the functional potential of T cells, independently of specific peptide.
Conclusions: Collectively, we propose that interactions with HLA-A2 per se (in absence of cognate peptide) led to TCR affinity-dependent chronic activation followed by hyporesponsiveness of HLA-A2/NY-ESO-1-specific CD8+ T cells. This TCR affinity-mediated hyporesponsive state is novel and has implications for the design of affinity-improved TCRs for immunotherapy. Indeed, affinity improvement of tumor/self antigen-specific TCRs beyond the physiological affinity range (KD < 1μM) might not provide further clinical benefit in adoptive CD8+ T cell transfer immunotherapy and might be associated with an increased risk of off-target toxicities.
Contexte: Les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques jouent un rôle majeur dans la formation d’une réponse immunitaire cellulaire adaptative contre les pathogènes intracellulaires et les cancers. L’élément clé dans l’initiation d’une réponse T CD8+ spécifique est la reconnaissance par le récepteur T (TCR) de peptides antigéniques présentés par le complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (MHC-I) à la surface de cellules infectées ou tumorales. La force de cette reconnaissance (ou affinité/avidité du TCR) représente l’un des paramètres majeurs influençant l’amplitude de la réponse T CD8+. Il est possible de trouver des lymphocytes T CD8+ autologues dirigés contre des antigènes tumoraux chez les patients atteints de cancer. Cependant, leur action reste souvent limitée, car les TCRs de ces cellules ne reconnaissent leur cible tumorale qu’avec une faible affinité, ce qui engendre une faible protection antitumorale. C’est pourquoi le transfert adoptif de lymphocytes T CD8+ modifiés génétiquement pour exprimer des TCR antitumoraux ayant des affinités améliorées représente une stratégie prometteuse afin d’augmenter la réponse antitumorale. Cependant, une modification de l’affinité du TCR inclut le risque d’augmenter des réponses cross-réactives de ces TCRs. Il est donc crucial d’approfondir nos connaissances en ce qui concerne la régulation fine des réponses CD8+ lorsque ces cellules expriment un TCR d’affinité optimisée.
Rational & Objectifs: Nous avons précédemment généré une série de TCRs avec des affinités améliorées contre l’antigène NY-ESO-1, présenté sur le MHC-I HLA-A2, afin d’étudier l’impact de l’affinité du TCR sur la réponse des lymphocytes T. Grâce à ce panel, nous avons découvert l’existence d’une fenêtre d’affinité optimale du TCR pour son antigène se situant au seuil supérieur physiologique et qui est associée à une fonctionnalité maximale des lymphocytes T CD8+. Nous avons découvert qu’une augmentation de l'affinité du TCR au-delà de ce seuil (définit ci-après comme un TCR supraphysiologique) induit une altération fonctionnelle drastique des cellules T CD8 +, liée à une augmentation de l’expression de PD-1. Cependant, les caractéristiques des voies de signalisation du TCR engendrant une activation et une fonctionnalité optimales des cellules T restent à résoudre ; tout comme les mécanismes régulateurs impliqués dans la réponse T selon l’affinité de leur TCR. Enfin, nous nous sommes demandés si les interactions chroniques entre un TCR avec une affinité améliorée et les molécules de MHC peuvent moduler directement la fonction des lymphocytes T CD8 antitumoraux.
Méthodologie: Dans cette thèse, nous avons utilisé la technique phospho-flow et le Western Blot pour évaluer l'expression et les niveaux de phosphorylation de molécules de signalisation clés du TCR. Nous avons utilisé la cytométrie en flux multicolore pour quantifier les niveaux d'expression des marqueurs de surface des cellules T. Enfin, nous nous sommes appuyés sur la technologie CRISPR / Cas9 pour éliminer certaines protéines d'intérêt afin d'étudier leur rôle dans la régulation par l’affinité de la voie de signalisation du TCR.
Projet 1: Le but de cette thèse était d’investiguer en détail les caractéristiques de la voie de signalisation du TCR lors d’une réponse T anti-tumorale optimale, ainsi que les dépendances de ce signal à la dose d’antigène. Nous avons découvert que les lymphocytes T CD8+ exprimant un TCR avec une affinité optimale possédaient une activité des voies de signalisation TCR proximales (CD3ζ) et distales (ERK1/2) plus haute et plus soutenue que les autres TCRs, indépendamment de la dose d’antigène. A l’inverse, dans les cellules exprimant un TCR supraphysiologique, l’initiation du signal était très forte mais peu soutenue, ce qui résultait en une activation inefficace de ERK1/2, même à des doses élevées d’antigène. En parallèle, nous avons observé qu’en condition de repos, ces cellules réduisaient leur niveau d’expression du complexe TCR/CD3 (Presotto, Erdes et al Front Immunol., 2017). Collectivement, ces découvertes ont montré que le potentiel d’activation des lymphocytes T CD8+ exprimant un TCR supraphysiologique était probablement inhibé par des mécanismes robustes de régulation négative, même en l’absence de stimulation peptidique. Nous avons appelé ce phénotype de tolérance associée à l’affinité « état hypo-responsif ».
Projet 2: En adoptant une approche ciblée, nous avons étudié la contribution de plusieurs mécanismes de régulation susceptibles de restreindre l'activation des lymphocytes T supraphysiologiques. Nous avons trouvé que la phosphatase SHP-1 régule négativement la signalisation TCR proximale (CD3ζ) et distale (ERK1/2), principalement dans les lymphocytes T CD8+ supraphysiologiques. En revanche, SHP-2 influençait positivement la signalisation TCR distale, sans affecter sa composante proximale. Ces découvertes montrent que la voie de signalisation du TCR peut être modulée par l’activité des protéines SHP-1 et SHP-2, dépendamment de l’affinité du TCR (Presotto, Erdes et al., Front. Immunol., 2017). Nous suggérons que ces régulations associées à l’affinité du TCR représentent un mécanisme potentiellement protecteur, afin d’empêcher des phénomènes auto-immuns causées par des TCRs de haute affinité.
Projet 3 : Finalement, nous avons recherché les raisons moléculaires associées à l’affinité du TCR qui seraient à l’origine de l’induction de l’état hypo-responsif de lymphocytes T antitumoraux en absence de stimulation peptidique. Nous avons émis l’hypothèse que les interactions entre le TCR supraphysiologique et la molécule HLA-A2 seraient suffisantes pour induire l’activation de ces cellules et le développement d’un état hypo-responsif. Et en effet, nous avons trouvé que l’expression de novo de HLA-A2 dans des lymphocytes T de très haute affinité n’exprimant initialement pas cette molécule, déclenchait la surexpression de marqueurs d’activation/inhibition comme PD-1 ou CD69, et était suivie par la perte d’expression du complexe TCR/CD3. En parallèle, ces cellules augmentaient également leur expression de CD5 et Cbl-b, deux molécules régulant négativement les niveaux d’expression du TCR (Duong, Erdes et al., manuscrit en révision). Nous avons observé que l’interaction soutenue entre un TCR d’affinité améliorée et les MHC ajustait directement le potentiel fonctionnel des lymphocytes T, indépendamment des peptides spécifiques.
Conclusions : En résumé, nous proposons que, dépendamment de l’affinité du TCR, l’interaction TCR-HLA-A2 per se (en toute absence de peptide spécifique) peut engendrer une activation chronique, suivie par un état hypo-réactif des lymphocytes T CD8 spécifiques pour HLA-A2/NY-ESO-1. La caractérisation de cet état hypo- réactif dépendant de l’affinité du TCR est nouvelle et a des implications pour l’ingénierie de TCRs à affinités améliorées pour l’immunothérapie. Ainsi, augmenter l’affinité de TCRs antitumoraux au-delà de la limite physiologique (KD < 1 μM) pourrait diminuer les bénéfices cliniques de l’immunothérapie par transfert adoptif de lymphocytes T, en plus d’être associé à un risque accru de réponses cross-réactives indésirables.