In the tumor microenvironment many strategies are at work to dampen T cell activation, allowing tumor immune escape. Among these, there is the stimulation of the co-inhibitory receptor PD1 on T cells by its ligand, PDL1, which is expressed on tumor cells. The PD1/PDL1 axis has been targeted with specific monoclonal antibodies, yielding significant clinical efficacy in several tumors. Nevertheless, these therapies have important limitations in terms of inefficient patient stratification, high occurrence of immune-related adverse effects and high cost of administration. The mechanism underlying PD1- mediated intracellular signalling remains poorly understood and represents a bottleneck in overcoming these difficulties.
Here we have demonstrated that PD1 engagement alters TCR trafficking, leading to increased total TCR levels the plasma membrane. This effect is likely attributed to a partial inhibition of TCR endocytosis, leading to a significant delay in TCR recycling due to decreased TCR internalization. Furthermore, we have discovered that PD1 triggering results in reduced TCR levels at the immunological synapse, which critically relies on TCR recycling. Based on these findings, we propose that PD1 engagement leads to a defect in the polarized recycling of the TCR to the IS.
To uncover the molecular mechanism underlying this observation, we have taken a mass spectrometry-based approach and identified VAMP3, a v-SNARE protein responsible for TCR delivery to the IS, to be less phosphorylated upon PD1 engagement. Expression of a phosphorylation-deficient- VAMP3 construct resulted in decreased TCR polarized recycling to the IS, likely due to impaired TCR+ vesicle fusion with the plasma membrane. Consequently, we postulate that PD1 hinders TCR polarized recycling, at least in part, by modulating VAMP3 phosphorylation.
Finally, we have discovered that the diminished TCR levels at the IS may be ascribable to a significant increase in TCR ectocytosis upon PD1 engagement. These findings identify a novel mechanism, not previously described to our knowledge, by which PD1 regulates TCR downmodulation at the IS, thereby inhibiting T cell activation. The molecular mechanism underlying this observation will be the object of future studies.
To conclude, the work of this thesis reveals that PD1 engagement alters TCR trafficking, specifically leading to impaired polarized recycling of the TCR to the IS, and increased TCR ectocytosis, thereby resulting in decreased TCR levels at the immunological synapse via two independent mechanisms. These findings provide fundamentally new insights into the mechanisms by which PD1 inhibits T cell activation, which could be of diagnostic and therapeutic relevance for PD1/PDL1-targeted immunotherapies.
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Dans le microenvironnement tumoral, de nombreuses stratégies sont à l'œuvre pour atténuer l'activation des cellules T, permettant ainsi à la tumeur de s'échapper du système immunitaire. Parmi celles-ci, il y a la stimulation du récepteur co-inhibiteur PD1 sur les cellules T par son ligand, PDL1, qui est exprimé sur les cellules tumorales. L'axe PD1/PDL1 a été ciblé avec des anticorps monoclonaux spécifiques, entraînant une efficacité clinique significative dans plusieurs types de tumeurs. Néanmoins, ces thérapies présentent des limitations importantes en termes de stratification inefficace des patients, de forte occurrence d'effets indésirables liés au système immunitaire et de coût élevé de l'administration. Le mécanisme sous-jacent à la signalisation intracellulaire médiée par PD1 reste mal compris et représente un obstacle pour surmonter ces difficultés.
Ici, nous avons démontré que l'engagement de PD1 altère le trafic du récepteur des cellules T (TCR), entraînant une augmentation du niveau de surface total de TCR à la membrane plasmique. Cet effet est probablement attribué à une inhibition partielle de l'endocytose de TCR, et une réduction consécutive de l'internalisation de TCR qui entraîne un retard significatif dans le recyclage du TCR. De plus, nous avons découvert que l'activation de PD1 entraîne une réduction des niveaux du TCR à la synapse immunologique (SI), qui dépend de manière critique du recyclage du TCR. Sur la base de ces résultats, nous proposons que l'engagement de PD1 entraîne un défaut dans le recyclage polarisé du TCR vers la SI. Pour découvrir le mécanisme moléculaire sous-jacent à cette observation, nous avons adopté une approche basée sur la spectrométrie de masse et identifié VAMP3, une protéine v-SNARE responsable de la délivrance du TCR à la SI, comme étant moins phosphorylée lors de l'engagement de PD1. L'expression d'une construction VAMP3 déficiente en phosphorylation a entraîné une diminution du recyclage polarisé de TCR vers la SI, probablement en raison d'une fusion altérée des vésicules TCR+ avec la membrane plasmique. Par conséquent, nous postulons que PD1 entrave le recyclage polarisé du TCR, au moins en partie, en modulant la phosphorylation de VAMP3.
Enfin, nous avons découvert que la diminution des niveaux du TCR à la SI peut être attribuable à une augmentation significative de l'ectocytose du TCR lors de l'engagement de PD1. Ces résultats identifient un nouveau mécanisme, jusqu'à présent non décrit à notre connaissance, par lequel PD1 régule la diminution du TCR à la SI, inhibant ainsi l'activation des cellules T. Le mécanisme moléculaire sous-jacent à cette observation fera l'objet d'études futures.
Pour conclure, le travail de cette thèse révèle que l'engagement de PD1 altère le trafic du TCR, entraînant spécifiquement un recyclage polarisé altéré du TCR vers la SI, et une augmentation de l'ectocytose du TCR, entraînant ainsi une diminution des niveaux du TCR à la SI via deux mécanismes indépendants. Ces résultats fournissent de nouvelles perspectives fondamentales sur les mécanismes par lesquels PD1 inhibe l'activation des cellules T, qui pourraient être d'une importance diagnostique et thérapeutique pour les immunothérapies ciblées sur PD1/PDL1.