Huntington’s disease (HD) is a fatal neurodegenerative disorder caused by a toxic gain- of-function CAG expansion in the first exon of the huntingtin (HTT) gene. Striatal neurodegeneration is the main hallmark in HD, but cortical neurons are also affected at early stages of the disease. Currently, there are no treatments stopping or slowing disease progression. The monogenic nature of HD makes CRISPR/Cas9-mediated HTT inactivation a promising therapeutic strategy. To facilitate the development of CNS gene therapies and maximize therapeutic efficacy for HD, we first developed 2D and 3D imaging workflows to evaluate the therapeutic potential of a novel strategy for HD by assessing transduction efficiency in multiple brain regions. We combine the retrograde transport properties of the AAV2.retro with the broad striatal diffusion of the AAV2/rh.10 to simultaneously inactivate the HTT gene in both striatal (SPNs) and cortical projection neurons (CPNs). Because constitutive SpCas9 expression increases the likelihood for the occurrence of off-target events and immunogenic responses, we used a transient AAV-based KamiCas9 system. Our analysis predicted that 54% of striatal cells and 7% of cortical cells had been transduced in highly targeted brain regions. Remarkably, in those regions, HTT gene inactivation reached 54.5% and 9.6%, respectively. These results validate the maximized therapeutic strategy and demonstrate the power of these quantitative workflows to predict the potential of gene therapy strategies for neurological disorders. Nevertheless, it is still unclear to which extent the loss of the wild-type HTT (wtHTT) normal functions may impact on disease progression. One of the current allele-specific therapeutic strategies for HD consists of the excision of the first exon of mutant HTT allele (mHTT) by inducing simultaneous double-strand breaks at upstream and downstream positions of the mHTT exon 1. However, its efficiency has never been assessed. Given the ultimate goal for clinical application, it is critical to accurately determine its efficiency to anticipate therapeutic potential. Therefore, here we developed digital PCR-based assays to accurately quantify the frequency of HTT exon 1 deletion events. Consistently with previous studies, we observed that deletion events are frequent in vitro, but extremely rare in vivo. Our results do not support the application of dual sgRNA-based deletion strategies for the in vivo treatment of HD or other CNS disorders. In addition, we highlight that the current methodologies to evaluate deletion events greatly overestimate their frequency. Overall, we encourage the scientific community to adopt more quantitative methods when analyzing complex gene editing events to avoid misleading conclusions concerning the applicability of such therapeutic strategies in vivo.
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La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative mortelle causée par une expansion CAG toxique à gain de fonction dans le premier exon du gène de la huntingtine (HTT). Cette maladie se caractérise principalement par la dégénérescence des neurones striataux, mais les neurones corticaux sont également touchés dans les premiers stades de la maladie. Actuellement, il n'existe aucun traitement capable d'arrêter ou de ralentir la progression de la maladie. La nature monogénique de la MH fait de l'inactivation HTT médiée par CRISPR/Cas9 une stratégie thérapeutique prometteuse. Pour faciliter le développement de thérapies géniques pour des maladies qui affectent le SNC et maximiser son efficacité thérapeutique pour la MH, nous avons développé des flux de travails basés sur de l’imagerie 2D et 3D. Cette méthodologie permet d'évaluer le potentiel thérapeutique d'une nouvelle stratégie pour la MH en évaluant l'efficacité de la transduction dans plusieurs régions du cerveau. Nous avons combiné les propriétés de transport rétrograde de l'AAV2.retro avec la large diffusion striatale de l'AAV2/rh.10 pour inactiver simultanément le gène HTT dans les neurones de projection striataux (NPSs) et corticaux (NPCs). Nous avons utilisé un système AAV-KamiCas9 transitoire car l'expression constitutive de SpCas9 augmente la possibilité d'événements hors cible et de réactions immunogènes. Les prédictions, selon notre analyse, sont que 54% des cellules striatales et 7% des cellules corticales ont été transduites dans des régions cérébrales hautement ciblées. De façon remarquable, dans ces régions, l'inactivation du gène HTT a atteint 54,5% et 9,6%, respectivement. Ces résultats valident la stratégie thérapeutique maximisée et démontrent la puissance de ces flux de travail pour prédire quantitativement le potentiel des stratégies de thérapie génique pour les maladies neurologiques. Néanmoins, on ne sait toujours pas dans quelle mesure la perte des fonctions normales de la HTT de type sauvage (wtHTT) peut avoir un impact sur la progression de la maladie. L'une des stratégies thérapeutiques actuelles, spécifique à l'allèle, pour la MH consiste à exciser le premier exon de l'allèle HTT mutant (mHTT) en induisant des cassures double brin simultanées en amont et en aval de l'exon 1 de la mHTT. Cependant, son efficacité n'a jamais été évaluée. Compte tenu de l'objectif ultime d'une application clinique, une détermination précise de l'efficacité est essentielle pour anticiper le potentiel thérapeutique. Par conséquent, nous avons développé ici des tests basés sur la PCR digitale pour quantifier avec précision la fréquence des événements de délétion de l'exon 1 du HTT. Conformément aux études précédentes, nous avons observé que les événements de délétion sont fréquents in vitro, mais extrêmement rares in vivo. Nos résultats ne soutiennent pas l'application de stratégies de délétion à base de double sgRNA pour le traitement in vivo de la MH ou d'autres maladies affectantle SNC. Par ailleurs, les méthodologies d'évaluation actuelles surestiment largement la fréquence d’événements de délétion. Dans l'ensemble, la communauté scientifique devrait adopter des méthodes plus quantitatives lors de l'analyse des événements complexes d'édition de gènes afin d'éviter des conclusions trompeuses concernant l'applicabilité de telles stratégies thérapeutiques in vivo.