SUMMARY
The p53 tumour suppresser gene is mutated in more than 50% of all human cancers. It encodes a transcription factor that, in response to oncogenic transformation and DNA damage, transactivates target genes to induce cell cycle arrest and apoptosis. How these upstream events signal to p53 at the molecular level is only poorly understood. It has been postulated that post-translational modifications of the p53 protein, like phosphorylation and acetylation, contribute to the regulation of p53 activity at the level of protein stability, interaction with transcriptional coactivator complexes, and DNA affinity. However, expression of non-modifiable p53 point mutants in tumour-derived cell lines that have lost endogenous p53 during tumorigenesis has in general failed to produce the expected changes in p53 activity. One possible explanation for this discrepancy is that the assays used previously employed in vitro systems or overexpressed p53 in cells with constitutive or defective signalling to p53.
I have examined several mechanisms of p53 regulation using cell lines that either express endogenous p53, or that respond appropriately to physiological levels of exogenously expressed p53. The results indicate that in cultured cells, p53 affinity for DNA is not regulated by genotoxic stress. Occupancy of apoptotic target gene promoters by p53 does not determine the choice between induction of apoptosis and growth arrest. Mutational analysis of the role of N-terminal phosphorylation has revealed that apoptosis was reduced by mutation of phosphorylation sites Ser15 and Ser20. Cell cycle arrest could be induced efficiently despite these mutations. Mutation of 6 N-terminal phosphorylation sites decreased induction of a subgroup of p53 target genes, whereas the induction of other target genes remained unaffected. In the system used for p53 re-expression, p53 stabilisation after DNA damage was neither dependent on these phosphorylation sites, nor on the feedback loop between MDM2 and p53. Finally, the study of p53-mediated acetylation of target gene promoters suggests that the p53 binding sites of highly occupied target gene promoters might contribute differentially to p53-mediated transactivation by recruitment of specific histone acetylase complexes.
RESUMÉ
Le gène p53 est un suppresseur de tumeurs muté à plus de 50% dans tous les types de cancers humains. Il code pour un facteur de transcription qui, en réponse à la transformation oncogénique et aux dommages à l'ADN, transactive ses gènes cible pour induire un arrêt du cycle cellulaire ou l'apoptose. La manière par laquelle les évènements en amont signalent vers p53 au niveau moléculaire est méconnue. Il a été postulé que les modifications post-traductionnelles de la protéine p53, comme l'acétylation et la phosphorylation, contribuaient à la régulation de l'activité de p53 au niveau de la stabilité protéique, de l'intéraction avec des complexes de co-activation transcriptionnelle, ou de l'affinité pour l'ADN. Toutefois, l'expression de mutants de p53 dans des lignées cellulaires dérivées de tumeurs ayant perdu le p53 endogène au cours de la tumorigénèse a en général échoué à produire les changements attendus dans l'activité de p53. Une explication pour cette différence réside dans le fait que les expériences précédemment effectuées utilisaient des systèmes in vitro, ou sur-éxprimaient p53 dans des cellules où les voies de signalisation vers p53 étaient constitutives ou défectueuses.
J'ai examiné différents mécanismes de régulation de p53, en utilisant des lignées cellulaires qui exprimaient un p53 endogène, ou qui répondaient d'une manière appropriée aux niveaux physiologiques d'un p53 exogène. Les résultats indiquent que l'affinité de p53 pour l'ADN n'est pas régulée par les stress génotoxiques dans les cellules en culture. L'occupation des promoteurs des gènes cibles apoptotiques ne determine pas le choix entre l'induction de l'apoptose ou de l'arrêt du cycle cellulaire. L'analyse par mutagénèse du rôle de la phosphorylation N-terminale a révélé que l'apoptose était réduite par la mutation des sites de phosphorylation Ser15 et Ser20. Toutefois, l'arrêt du cycle cellulaire est induit en dépit de ces mutations. La mutation simultanée de six sites de phosphorylation N-terminaux réduit l'induction d'un sous-groupe de gènes cible de p53, tandis que l'induction d'autres gènes cible reste inaffectée. Dans le système utilisé pour la ré-expression de p53, la stabilisation de p53 après dommages à l'ADN n'est pas dépendante de ces sites de phosphorylation, ni de la boucle de régulation négative entre MDM2 et p53. Finalement, l'étude de l'acétylation p53- dépendante du promoteur des gènes cible suggère que les sites de liaison à p53 des promoteurs hautement occuppés pourrait contribuer différentiellement à la transactivation en recrutant des complexes spécifiques d'acétylation des histones.