SUMMARY
A precise regulation of neuronal growth is crucial for a correct development and establishment of the nervous system. Neuronal growth associated proteins (nGAPs), such as SCG10, play a prominent role in axonal outgrowth. By governing microtubule (MT) dynamics, SCG10 forms part of the machinery that promotes axonal elongation and in turn the establishment of neural circuits. It is plausible to believe that SCG10 may have other functions in the growing neuron besides MT regulation. A previous study found rabaptin-5, an effector protein of Rab5 that is important in endocytic regulation, to be a putative interacting partner of SCG10. Data obtained in this work support the assumption that there is an interaction between SCG10 and rabaptin-5 and in addition demonstrated a direct involvement of SCG10 in endocytosis.
F-actin also forms part of the growth cone, and there are most likely close interactions between proteins regulating actin dynamics and microtubule depolymerizing proteins such as SCG10. In this study, a protein that has not been previously characterized was identified as a putative interaction partner of SCG10. The protein was named SCG10 Interacting Protein 1 (SIP1). It has homology to an actin-interacting protein in the plant Arabidopsis thaliana and also to a mouse D-lactate dehydrogenase (mDLD), which in turn has been found to interact with an actin-associated cysteine-rich protein (CRP). Future experiments will hopefully clarify whether SIP1 and SCG10 interact in vivo and if SIP1 plays a direct or indirect role in actin dynamics in the growing neuron.
SCG10 is a phosphoprotein. Previous studies have demonstrated that it can be phophorylated in vitro by several kinases and that its state of phosphorylation will affect its microtubule destabilizing activity. In this study, the phosphorylation and other posttranslational modifications of SCG10 during mouse development were investigated. The data presented show that SCG10 exists in multiple phosphoforms (with respect to serine residues 50, 62, 73 and 97 identified by mass spectrometry as phosphorylation sites) in 129/Sv P5 mouse brain and that, in addition, it is tyrosine phosphorylated. Previous work demonstrated that SCG10 exists in both membrane-associated and soluble forms. Differences in the expression of phosphoforms of SCG10 occur in the cytosol and membrane fraction of embryonic day 14, postnatal day 5 and adult mice. It is in the membrane-associated form that SCG10 is completely phosphorylated on the afore mentioned serines. In addition, when inhibiting protein kinase A, mitogen-activated protein kinase and Ca2+/calmodulin kinase II in P012-ES cells, the phosphorylation of SCG10 on serines 50 and 62 decreased, thus confirming that these kinases can phosphorylate SCG10 in vivo.
RESUME
Une régulation précise de la croissance neuronale est cruciale pour le bon développement et la mise en place des connexions du système nerveux central. Les protéines associées à la croissance neuronale (nGAPs) telles que SCG10 jouent un rôle prépondérant dans l'extension neuronale. Par la régulation de la dynamique des microtubules (MT), SCG10 fait partie des protéines qui participent aux mécanismes permettant l'élongation axonale et de fait l'établissement de circuits neuronaux. Il est concevable d'imaginer que SCG10 puisse avoir d'autres fonctions dans les neurones en croissance que la régulation des MT. Une étude précédente a trouvé que rabaptin-5, une protéine effectrice de Rab5 qui est importante dans la régulation de l'endocytose pourrait être un partenaire potentiel de SCG10. Les données obtenues dans ce travail supportent l'idée d'une interaction entre SCG10 et rabaptin-5 et démontrent une implication directe de 50010 dans l'endocytose.
Les F-actines font également partie du cône de croissance. Probablement d'autres interactions entre les protéines régulant le dynamisme de l'actine et des protéines de dépolymérisation des MT telles que SCG10 existent. Dans cette étude, une protéine inconnue nommée Protéine Interagissant avec SCG10 (SIP1) fut identifiée comme partenaire potentielle de SCG10. SIP1 partage une homologie avec une protéine de la plante Arabidopsis thaliana interagissant avec l'actine, ainsi qu'avec une D-Lactate déshydrogénases (mDLD) qui interagit avec une protéine riche en cystéine associée à l'actine (CRP). Les futures expériences vont certainement confirmer si SIP1 et SCG10 interagissent in vivo et si S1P1 joue un rôle direct ou indirect dans la régulation de la fonction de l'actine dans la croissance neuronale.
SCG10 est une phosphoprotéine. Des études précédentes ont démontré qu'elle pouvait être phosphorylée par diverses kinases et que son état de phosphorylation affecte son activité de déstabilisation des MT. Dans cette étude, la phosphorylation et autres modifications post-translationelles de SCG10 pendant le développement de la souris furent étudiées. Les données obtenues indiquent que de multiples phosphoformes (comme les sites de phosphorylation des sérines 50, 62, 73 et 97 identifiées par spectrométrie de masse) de SCG10 existent dans les cerveaux de souris sv129 au stade P5. De plus, les tyrosines sont phosphorylées. Des études précédentes ont démontré que SCG10 existe sous forme soluble ou attachée à la membrane. Sous cette dernière forme, toutes les sérines de SCG10 mentionnées précédemment sont phosphorylées. Des différences dans l'expression des phosphoformes de SCG10 sont constatées dans le cytosol et les membranes au stade embryonnaire (14 jours de gestation), au 5eme jour postnatal, ainsi que chez la souris adulte.
De plus, lors de l'inhibition de la protéine kinase A, de la kinase activée par la mitose et la calcium calmoduline kinase II dans les cellules PC12-ES, la phosphorylation des sérines 50 et 62 de SCG10 est diminuée, confirmant la phosphorylation de SCG10 in vivo.