Abtract:
Cryo-electron microscopy of biological unordered and non aggregated molecules is a powerful approach for macromolecular assemblies, which are often too large and flexible to be studied by X-ray crystallography. Low temperature that preserves the native hydrated macromolecular structure confers to this technique the power to study conformational changes. Electron micrographs are very noisy and show low intrinsic contrast. Although there is no limits to the mass of the particles that can be analysed, experience place a lower size cutoff of ~250 kDa molecular weight. In order to go beyond these limits, the cryo-negative staining has been developped in our laboratory. The presence of a stain (molybdate amonium) makes possible to vizualize the particles with a enhanced SNR while keeping the specimen in a good state of preservation and reducing electron-beam sensity of vitrified specimen. In the present work, this method allowed us the study of two different pore forming toxins (PFTs), the Helicobacter Pylori vacuolating toxin,'VacA' unrelated to any other proteins, and a mutant form of the Aeromonas Hydrophila toxin, aerolysin (Y221G). Image analysis and 3D reconstruction of the wild type toxin VacA revealed that the monomer assembled into a number of different oligomers, all of which keeping elements of remarkable mobility. The structural comparaison of the wild type form of VacA and a mutant form where a unique hydrophobic region located near its amino terminus was deleted helped us to localize this hydrophobic domain whithin the VacA oligomeric structure and to provide insight into how this domain contributes to the formation of membrane channels by VacA. A high resolution model of a mutant form of aerolysin (Y221G), where a single point mutation has converted a normally membrane-embeded toxin into a soluble complex was obtained by the combination of X-ray data with the electron microscopy map. This model helped us to understand the role of the tyrosine 221 in the exposition of the hydrophobic regions that form the membrane- inserted channel. Finally, the small protein (~200 kDa) dipeptidyl-peptidase IV was also any studied by this technique.
Résumé
La cryo-microscopie électronique des molécules biologiques désordonnées et désagrégées est une approche puissante pour l'étude structurale d'assemblages macromoléculaires trop volumineux pour être étudiés par cristallographie aux rayons X. La basse température à laquelle les spécimens sont observés préserve les macromolécules dans leur état natif et hydraté et confère à cette technique le pouvoir d'étudier les différents états conformationnels. Les images de microscopie électronique obtenues, sont bruitées et présentent un contraste faible limitant ainsi l'observation de particules de faible poids moléculaire d'environ 250 kDa. Afin de surpasser ces limites, la cryo-coloration négative a été développée dans notre laboratoire. La présence d'un colorant (le molybdate d'ammonium) permet la visualisation des particules avec un rapport signal-sur-bruit augmenté tout en préservant le spécimen et en le protégeant des dégâts du faisceau électronique. Dans ce travail, cette méthode nous a permis d'étudier deux toxines bactériennes différentes formant des pores membranaires, la toxine VacA d'Helicobacter pyïori apparentée à aucune autre toxine connue et une forme mutante de la toxine aérolysine d'Aeromonas Hydrophila (Y221G). Le traitement d'images et la reconstruction tri-dimensionnelle de la toxine VacA de type sauvage a permis de mettre en lumière l'assemblage des monomères en oligomères tout en conservant des éléments d'une remarquable mobilité. La structure de la forme mutante de VacA pour laquelle l'unique région hydrophobe a été tronquée est comparée avec celle de la forme de type sauvage Cette comparaison a mis en évidence la localisation de ce domaine hydrophobe à l'intérieur de la structure des oligomères ainsi que la contribution de ce domaine dans la formation de canaux membranaires par VacA. La toxine aérolysine (Y221G) est le résultat d'une mutation unique qui permet la conversion d'une toxine insérée dans une membrane en un complexe soluble. Un modèle à l'échelle atomique a été obtenu pour ce mutant en combinant la carte de microscopie électronique tri-dimensionnelle aux données de cristallographie aux rayons X. Ce modèle souligne le rôle de la tyrosine 221 dans l'exposition des régions hydrophobes qui forment le canal membranaire. Enfin, la dernière protéine étudiée, la dipeptidyl-peptidase (DPPIV) (~200 kDa) a démontré que la cryo-coloration négative permet l'étude structurale de protéines plus petites que celles qui ont été d'étudiées jusqu'ici.