Cell signalling is a fundamental process enabling cells to adapt to external stimuli, thereby orchestrating appropriate responses to environmental changes. In fission yeast, the absence of nitrogen triggers sexual differentiation, marked by pheromone signalling between M-cells and P- cells, leading to the formation of zygotes and spores that stay dormant until nutrients become available.
Pheromone signalling relies on a MAPK signalling module composed of the MAPKKK Byr2, the MAPKK Byr1, and the MAPK Spk1, which play important roles in driving sexual differentiation by promoting a transcriptional response essential for pheromone recognition and cellular polarization toward a partner.
Upon cell pairing, an aster-like structure called the fusion focus assembles, concentrating vesicles containing cell wall hydrolytic enzymes at the cell-cell contact site, facilitating fusion. Previous investigations have indicated that all three components of the MAPK cascade localize to this actin structure and contribute to its stability, precisely regulating the release of cell-wall hydrolases to promote fusion.
In this study, I employed phospho-proteomic analyses to gain comprehensive insights into signalling pathway alterations during sexual differentiation and upon cell-cell fusion. Additionally, phospho-proteomic experiments were conducted on sexually differentiated cells following acute inhibition of MAPK signalling, resulting in the identification of specific MAPK substrates. Given that nitrogen starvation is the primary trigger for sexual differentiation, we also provide a dataset documenting changes in phosphorylation patterns upon nitrogen deprivation.
In the course of this study, I identified two proteins Mug8 and Mug9, which are involved in the cell-cell fusion process and showed that phosphorylation event on Mug8 contributes to its functional role. I also identified that ribosomal protein S6 was phosphorylated at serine 235 and serine 236 specifically during sexual differentiation. Those phosphorylation sites are a hallmark of protein S6 kinase phosphorylation. My analysis revealed that these Rps6 phosphorylation events are indeed dependent on the S6 kinase protein Psk1, a direct target of the Target of Rapamycin Complex
1 (TORC1), a complex promoting cell growth in the presence of nitrogen source. TORC1 is inactivated at the onset of sexual differentiation and thus my work provides evidence that this complex is reactivated during mating in a pheromone signalling dependent manner.
Lastly, my research led to the identification of a novel protein, which I named Dpf1 for "Disordered protein involved in cell-cell fusion” and showed that this protein is crucial for the cell-cell fusion process. Furthermore, my analysis suggests that Dpf1 is a substrate of the MAPK Spk1.
Collectively, this study provides a comprehensive understanding of the dynamic phosphorylation events that underlie sexual differentiation and cell-cell fusion in fission yeast, shedding light on previously unexplored components and regulatory mechanisms of these processes.
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La signalisation cellulaire est un processus fondamental permettant aux cellules de s'adapter aux stimuli externes, orchestrant ainsi des réponses appropriées aux changements environnementaux. Chez la levure à fission, l'absence d'azote déclenche la différenciation sexuelle, marquée par la signalisation des phéromones entre les cellules M et les cellules P, conduisant à la formation de zygotes et de spores qui restent dormants jusqu'à ce que des nutriments soient disponibles.
La signalisation des phéromones repose sur un module de signalisation MAPK composé de la MAPKKK Byr2, de la MAPKK Byr1 et de la MAPK Spk1, qui jouent un rôle essentiel dans la promotion de la différenciation sexuelle en favorisant une réponse transcriptionnelle essentielle à la reconnaissance des phéromones et à la polarisation cellulaire vers un partenaire.
Lors de l'appariement des cellules, une structure en forme d'astre appelée le « fusion focus » se forme, concentrant des vésicules contenant des enzymes hydrolytiques de la paroi cellulaire au niveau du site de contact entre les cellules, facilitant ainsi la fusion. Des recherches antérieures ont indiqué que les trois composants de la cascade MAPK se localisent sur cette structure d'actine et contribuent à sa stabilité, régulant précisément la libération des enzymes qui digèrent la paroi cellulaire.
Dans le cadre de cette étude, j'ai réalisé des analyses de phospho-protéomique afin d'obtenir une compréhension complète des modifications des voies de signalisation au cours de la différenciation sexuelle et lors de la fusion cellulaire. De plus, des expériences de phospho- protéomique ont été menées sur des cellules différenciées sexuellement à la suite de l'inhibition aiguë de la signalisation MAPK, ce qui a permis d'identifier des substrats spécifiques de la MAPK.
Étant donné que la privation d'azote est le principal déclencheur de la différenciation sexuelle, nous fournissons également un ensemble de données documentant les changements dans les schémas de phosphorylation lors de cette privation.
Au cours de cette étude, j'ai identifié deux protéines, Mug8 et Mug9, qui sont impliquées dans le processus de fusion cellulaire et montré que l'événement de phosphorylation sur Mug8 contribue
à son rôle fonctionnel. J'ai également identifié que la protéine ribosomique S6 était phosphorylée au niveau des sérines 235 et 236 spécifiquement lors de la différenciation sexuelle. Ces sites de phosphorylation sont une caractéristique de la phosphorylation de la protéine S6 kinase. Mon analyse a révélé que ces événements de phosphorylation de Rps6 dépendent effectivement de la protéine S6 kinase Psk1, une cible directe du complexe cible de la rapamycine 1 (TORC1), un complexe favorisant la croissance cellulaire en présence de sources d'azote. TORC1 est inactivé au début de la différenciation sexuelle, et donc mon travail apporte la preuve que ce complexe est réactivé au cours de ce processus d'une manière qui dépend de la signalisation des phéromones.
Enfin, mes recherches ont permis d'identifier une nouvelle protéine, que j'ai nommée Dpf1 pour "protéine désordonnée impliquée dans la fusion cellulaire", et ont montré que cette protéine est cruciale pour le processus de fusion cellule-cellule. De plus, mon analyse suggère que Dpf1 est un substrat de la MAPK Spk1.
Dans l'ensemble, cette étude offre une compréhension globale des événements de phosphorylation dynamique sous-jacents à la différenciation sexuelle et à la fusion cellulaire chez la levure à fission, éclairant ainsi des composants et mécanismes de régulation jusqu'alors inexplorés de ces processus.