The fundamental knowledge of how bacterial cell divides and behaves is key, and is the basis to new therapeutic avenues that can be developed to combat bacteria, such as the human pathogen Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). To infer gene function and to identify new genes involved in the cell cycle, genetic interactions mapping is a powerful tool. Genetic interactions can help to identify functional dependency, where two genes are synthetic lethal, or mechanistic connection, when the removal of a gene alleviate the fitness defect created by another gene removal. Therefore, genetic interaction networks identify functional connections between genes and pathways. These insights can be leveraged to ascertain new gene functions, identify drug targets, and indicate interdependencies among various pathways. Current Next-Generation Sequencing (NGS) techniques, including transposon mutagenesis (Tn-Seq) and CRISPR interference followed by high-throughput sequencing (CRISPRi-Seq), are exceptionally adaptable and scalable, facilitating effective analysis across diverse conditions, such as varying growth mediums or antibiotic concentrations. However, across different genetic backgrounds to screen for genetic interactions on a genome-wide level, these techniques have not yet been adapted. Furthermore, while existing methods allow the identification of genetic interactions among a select few genes, they fall short in enabling comprehensive, genome-wide analysis.
In that sense, we develop in this thesis new genetic interactions screenings methods. In Chapter 2, we develop Dual CRISPRi-Seq, relying on the fitness quantification of sgRNA pairs to map genetic interactions on a genome-wide basis. We pooled together 378’015 unique sgRNA combinations spanning over 70% of the genes present in Streptococcus pneumoniae. The resulting genetic interaction network highlighted key links between cellular processes, such as interdependency between cell division and cell elongation, as well as the importance of chromosome segregation during cell elongation.
In Chapter 3, we develop CRISPRi-TnSeq, exploiting the advantages of both CRISPRi and Tn-Seq techniques. As Tn-Seq cannot sample essential genes, we enabled genetic interaction mapping by targeting essential genes by CRISPRi, followed by sampling non- essential genes by Tn-Seq. Combining these two screening methods allowed us to the identification of pleiotropic genes that provide robustness to the organism, insights into relationships between genes involved in cell wall synthesis and division, as well as compensation mechanisms by non-essential genes for the loss of essential genes.
Additionally, as teichoic acids are important in the pneumococcus to cell wall integrity, host-pathogen interactions, and physiology, we characterize the structure and function of the teichoic acid flippase TacF in Chapter 4. We successfully elucidated TacF conformation for
the first time, and identified key amino acids involved in the function of TacF, advancing our understanding of the teichoic acid pathway.
In the Chapter 5, we shift focus into the development of BactEXTRACT, an R Shiny application facilitating the bacterial growth analysis and plotting through a user-friendly interface. The application simplifies the transition from raw optical density measurements of bacterial growth to publication-ready plots and growth parameters, such as growth rate and generation time.
In summary, this thesis introduces innovative methodologies to the genomics toolbox for identifying novel gene functions through genetic interactions mapping. Comprehending gene function and uncovering new mechanisms are key steps toward discovering potential therapeutic avenues, forming a vital component in combating the silent crisis of antimicrobial resistance.
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Il est essentiel de comprendre les principes fondamentaux régissant la division et le comportement des bactéries. Cela constitue la base de nouvelles voies thérapeutiques pouvant être développées pour lutter contre les bactéries, telles que le pathogène humain Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque). La cartographie des interactions génétiques est un puissant outil pour déduire la fonction des gènes et identifier de nouveaux gènes impliqués dans le cycle cellulaire. Les interactions génétiques peuvent aider à identifier la dépendance fonctionnelle, où deux gènes sont synthétiquement létaux, ou la connexion mécanistique, lorsque le retrait d'un gène atténue le défaut de fitness créé par le retrait d'un autre gène. Ainsi, les réseaux d'interactions génétiques identifient des connexions fonctionnelles entre gènes et voies métaboliques. Ces perspectives peuvent être exploitées pour déterminer de nouvelles fonctions géniques, identifier des cibles médicamenteuses et indiquer des interdépendances parmi diverses voies métaboliques. Les techniques actuelles de séquençage de nouvelle génération (NGS), y compris la mutagenèse par transposon (Tn- Seq) et l'interférence CRISPR (CRISPRi) suivie de séquençage (CRISPRi-Seq), sont exceptionnellement flexibles et évolutives, facilitant une analyse efficace dans diverses conditions. Ces méthodes permettent l’identification d’interactions génétiques entre quelques gènes d’intérêts, mais pas l’identification globale à l’échelle du génome.
Dans ce sens, nous développons dans cette thèse de nouvelles méthodes de criblage d'interactions génétiques. Dans le chapitre 2, nous développons Dual CRISPRi-Seq, basé sur la quantification du fitness de paires de sgRNAs pour cartographier les interactions génétiques à l'échelle du génome. Nous avons regroupé 378'015 combinaisons uniques de sgRNA couvrant plus de 70 % des gènes présents dans Streptococcus pneumoniae D39V. Le réseau d'interaction génétique résultant a mis en évidence des liens clés entre les processus cellulaires, tels que l'interdépendance entre la division cellulaire et l'élongation cellulaire, ainsi que l'importance de la ségrégation chromosomique pendant l'élongation cellulaire.
Dans le chapitre 3, nous développons CRISPRi-TnSeq, exploitant les avantages des techniques CRISPRi et Tn-Seq. Comme Tn-Seq ne peut pas échantillonner les gènes essentiels, nous avons permis la cartographie des interactions génétiques en ciblant des gènes essentiels par CRISPRi, suivie de l'échantillonnage des gènes non essentiels par Tn- Seq. La combinaison de ces deux méthodes de criblage nous a permis d'identifier des gènes pléiotropes qui confèrent une robustesse à l'organisme, des relations entre les gènes impliqués dans la synthèse et la division de la paroi cellulaire, ainsi que des mécanismes de compensation par les gènes non essentiels pour la perte de gènes essentiels.
De plus, comme les acides téichoïques sont importants dans le pneumocoque pour l'intégrité de la paroi cellulaire, les interactions hôte-pathogène et la physiologie, nous caractérisons la structure et la fonction de la flippase d'acide téichoïque TacF dans le chapitre
4. Nous avons réussi à élucider pour la première fois la conformation de TacF, et identifié des acides aminés clés impliqués dans la fonction de TacF, faisant avancer notre compréhension de la voie de l'acide téichoïque.
Dans le chapitre 5, nous nous concentrons sur le développement de BactEXTRACT, une application R Shiny facilitant l'analyse et la représentation graphique de la croissance bactérienne. L'application simplifie la transition de mesures brutes de la densité optique de la croissance bactérienne à des graphiques prêts pour la publication et des paramètres de croissance, tels que le taux de croissance et le temps de génération.
En résumé, cette thèse introduit des méthodologies innovantes dans la boîte à outils génomique pour identifier de nouvelles fonctions géniques à travers la cartographie des interactions génétiques. Comprendre la fonction des gènes et découvrir de nouveaux mécanismes sont des étapes clés vers la découverte de voies thérapeutiques potentielles, formant un composant vital dans la lutte contre la crise silencieuse de la résistance aux antimicrobiens.
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The quintessential process of a bacterial cell splitting into two is fundamental for its growth. In bacteria such as the human pathogen Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus), understanding how the bacteria divide and behave is the basis to new therapeutic avenues that can be developed to fight against the silent crisis of antimicrobial resistance. One way to discover new cell division mechanisms is through the study of genetic interactions which can emphasize how genes depend on each other, based on their essentiality for sustaining growth. For instance, if removing two genes together causes a bigger problem for the cell growth than expected, a functional dependency between the two genes can be described. In opposite, a mechanistic connection can be observed, when the removal of a gene alleviates the fitness defect created by the removal of another gene. Therefore, genetic interaction studies identify functional connections between genes and pathways. These insights can be leveraged to ascertain new gene functions, identify drug targets, and indicate interdependencies among various pathways. While existing methods enable the identification of genetic interactions among a select few genes, they fall short in enabling comprehensive, genome-wide analysis.
Therefore, we develop two new methods in Chapter 2 and 3, Dual CRISPRi-Seq and CRISPRi-TnSeq, allowing the identification of genetic interactions on a genome-wide level in
S. pneumoniae. The resulting identified genetic interactions allowed us to construct a genetic interaction network of the pneumococcus, highlighting key links between cellular processes, such as interdependency between cell division and cell elongation, as well as the importance of chromosome segregation during cell elongation. These two methods also enabled the identification of genes that provide robustness to S. pneumoniae, and insights into relationships between genes involved in cell wall synthesis and cell division.
We shift focus in Chapter 4, as we try to characterize the function of a specific protein involved in the cell wall structure of S. pneumoniae, TacF. We elucidated the shape and structure of TacF for the first time. We also describe important building blocks of the protein, called amino acids that are crucial for TacF to function properly.
Lastly, in Chapter 5, we develop an application to facilitate bacterial growth analysis, called BactEXTRACT. The application simplifies the transition between raw optical density measurements of bacterial growth to customizable plots.
This thesis introduces innovative methodologies to identify novel gene functions through genetic interactions mapping. Comprehending gene function and uncovering new mechanisms are key steps toward discovering potential therapeutic avenues, forming a vital component in combating the silent crisis of antimicrobial resistance.
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Il est essentiel de comprendre les principes fondamentaux régissant la division et le comportement des bactéries. Pour les bactéries telles que le pathogène humain Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque) qui peut provoquer pneumonies, méningites et sepsis, cette connaissance constitue la base de nouvelles voies thérapeutiques pouvant être développées pour combattre efficacement ces infections. L’dentification des interactions génétiques est un puissant outil, qui peut souligner comment les gènes dépendent les uns des autres, en fonction de leur nécessité pour soutenir la croissance de la cellule. Par exemple, on peut décrire une dépendance fonctionnelle entre deux gènes, lorsque la suppression simultanée de deux gènes provoque un défaut de croissance beaucoup plus sévère que si l’on supprime individuellement chacun des gènes. À l'inverse, une connexion mécanistique peut être observée lorsque la suppression d’un gène atténue le défaut de croissance créé par la suppression d’un autre gène. Ainsi, les études d'interaction génétique identifient des connexions fonctionnelles entre les gènes. L’exploitation de ces connexions peut aider à déterminer de nouvelles fonctions génétiques, d’identifier des cibles thérapeutiques, et d’indiquer des relations entre divers processus et mécanismes de croissance cellulaire. Les méthodes actuelles permettent l’identification d’interactions génétiques entre quelques gènes d’intérêts, mais pas l’identification globale à l’échelle du génome.
C’est pourquoi nous présentons dans le Chapitre 2 et 3 deux nouvelles méthodes, Dual CRISPRi-Seq et CRISPRi-TnSeq, permettant l’identification des interactions génétiques à l’échelle du génome de S. pneumoniae. L’application de ces deux méthodes nous ont permis de construire d’un réseau d’interactions génétiques du pneumocoque, l’identification de gènes fournissant une robustesse au pneumocoque, ainsi que des liens clés entre les processus cellulaires, tels que l’interdépendance entre des gènes impliqués dans la division cellulaire et des gènes impliqués dans la synthèse de la paroi cellulaire.
Nous décrivons dans le Chapitre 4 la caractérisation de TacF, une protéine impliquée dans la synthèse de la paroi cellulaire. Nous démontrons sa conformation, ainsi que l’importance de certains acides aminés dans sa fonction. Finalement, nous développons dans le Chapitre 5 une application pour faciliter l’analyse de la croissance bactérienne.
En résumé, cette thèse introduit des méthodologies innovantes, pour identifier de nouvelles fonctions géniques à travers la cartographie des interactions génétiques. Comprendre la fonction des gènes et découvrir de nouveaux mécanismes sont des étapes clés vers la découverte de voies thérapeutiques potentielles, formant un composant vital dans la lutte contre la résistance bactérienne aux antibiotiques.