Objectif
Présenter le développement d’une méthode HPLC-MRM/MS de grande échelle appliquée à l’analyse métabolomique ciblée.
Description
La métabolomique vise à étudier l’ensemble des molécules de bas poids moléculaire contenues dans des cellules, tissus, organismes ou fluides biologiques. L’approche ciblée a pris une grande importance ces dernières années en métabolomique. Grâce à leur grande sensibilité, sélectivité et robustesse les spectromètres de masses de type triple quadripôle (QqQ) utilisés en mode d’acquisition multiple reaction monitoring (MRM), proposent un excellent moyen pour le profilage métabolomique, permettant l’analyse simultanée de centaines de molécules impliquées dans diverses voies métaboliques d’importance. Des efforts considérables ont été fournis pour augmenter le nombre de métabolites mesurés, rendant cette approche de plus en plus populaire. En effet, la possibilité de détecter une large gamme de métabolites connus rend ainsi possible l’utilisation et l’application de la métabolomique dans des études clinique [1].
Méthode
Les échantillons biologiques ont été traités par précipitation de protéines. Après évaporation et reconstitution les extraits sont injectés sur un système HPLC Ultimate 3000 (Dionex) et séparés sur une colonne en phase inverse Kinetex RP C18 (Phenomenex). Le système HPLC est couplé à un spectromètre de masse de type hybride triple quadripôle trappe linéaire Qtrap 5500™ (Sciex). L’acquisition a été faite en mode MRM. La méthode MRM est composée de 581 transitions correspondant à un total de 566 métabolites endogènes et exogènes. Chaque échantillon a été analysé en mode d’ionisation positif et négatif. Finalement, l’intégration des pics détectés a été faite avec le logiciel de quantification Multiquant (Sciex).
Résultats
Différentes matrices biologiques ont été analysées tel que le plasma, l’urine ou encore des spots de sang séché (DBS). La méthode a permis la détection de plus 200 métabolites dans le plasma et environ 240 dans l’urine. Ces métabolites sont impliqués dans différente voie métabolique tel que le cycle d l’acide citrique, la glycolyse et le métabolisme des acides aminée. En parallèle, des échantillons plasmatiques contrôles ont été analysés sur une période de plusieurs mois dans le but de démontrer la stabilité analytique du système utilisé. L’analyse des ces contrôles qualités plasmatiques n’a montrée aucune déviation analytique démontrant la robustesse de la méthode développée.
Conclusion
Le développement de cette méthode HPLC-MRM/MS de grande échelle a démontré la robustesse, la sélectivité et la sensibilité nécessaire pour l’application dans différent domaine d’application cliniques et médico-légales.