Characterization of pharmacological modulators and study of ASIC activation with cysteine-based cross-linking

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ID Serval
serval:BIB_1910F37FB68D
Type
Thèse: thèse de doctorat.
Collection
Publications
Institution
Titre
Characterization of pharmacological modulators and study of ASIC activation with cysteine-based cross-linking
Auteur(s)
VAITHIA NATHA SUBRAMANIAN Anand
Directeur(s)
KELLENBERGER Stephan
Détails de l'institution
Université de Lausanne, Faculté de biologie et médecine
Statut éditorial
Acceptée
Date de publication
2021
Langue
anglais
Résumé
Acid-sensing ion channels (ASICs) are proton-gated, voltage-insensitive Na+ channels that are localized in the central and the peripheral nervous system participating in a range of physiological and pathological functions such as pain sensation, learning and memory, fear, and neurodegeneration after stroke. ASICs form homo- or heterotrimeric channels. ASIC structures of the closed, toxin-bound open and the desensitized state have been solved. Despite the available high-resolution ASIC structures, it is not known exactly how protons activate ASICs. Using experimental approaches, the structure-function relationship of ASIC activity was investigated here in three sub-projects. 1) 2-guanidine-4-methylquinazoline (GMQ) is a known pharmacological modulator of ASIC1a and ASIC3. New derivatives of GMQ were studied. Several quniazoline and quinoline derivatives produced a modulatory effect on ASIC activity in a sub-type specific manner. Guanidinopyridines strongly inhibited the peak current at pH5 in ASIC1a and ASIC3 with 20-fold better potency than GMQ. Interestingly, 2-guanidino- quinolines and -pyridines produced in ASIC1a a potentiation at low, and an inhibition at high concentrations. 2) Comparison of the rare mutation D212 in hASIC1a that was used in many laboratories as wild type, with the real wild type human ASIC1a-G212 showed slower current decay kinetics, higher current amplitude per surface-expressed channel, increased surface expression of the channel, and a stronger dependence of the current decay kinetics on the extracellular anion in hASIC1a-G212. 3) To test the effect of distance constraints on channel function, the optical tweezer 4,4’-bis(maleimido)azobenzene (BMA) and bis-methane- thiosulfonate (MTS) cross-linkers were used. In hASIC1a-I428C to which BMA was tethered, light-dependent activation by 440nm light was observed, however without the formation of a cross-link. A modulatory effect by BMA upon 360nm light illumination was found in three double mutants of the extracellular domain. In a second approach, MTS cross-linkers of different lengths were used. In comparison to control condition, treatment with MTS-17-MTS produced an acidic-shift of the pH dependence of activation in hASIC1a-D237C/I312C, and an alkaline or a small acidic-shift in the single mutants, hASIC1a-I312C and -D237C. Further validation of cross-linking is required in D237C/I312C. Our findings provide structural insights into ASIC1a activity.
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Les canaux ioniques sensibles à l'acide (ASIC) sont des canaux à sodium, proton- dépendants et insensibles au voltage, localisés dans le système nerveux central et périphérique. Ils participent à une gamme de fonctions physiologiques et pathologiques telles que la sensation de douleur, l'apprentissage et la mémoire, la peur et sont impliqués dans la neurodégénérescence après un AVC. Les ASIC forment des canaux homo- ou hétérotrimériques. La structure du poulet ASIC1a a été résolue à l'état fermé, dans l’état ouvert lié à la toxine, et désensibilisé et pour l'ASIC1a humaine (hASIC1a) dans l'état fermé. Malgré les structures ASIC haute résolution disponibles, on ne sait pas exactement comment les protons activent les ASIC. À l'aide d'approches expérimentales, la relation structure-fonction de l'activité ASIC1a a été étudiée. Dans ce contexte 1) la 2-guanidine-4-méthylquinazoline (GMQ) est un modulateur pharmacologique connu des ASIC1a et ASIC3, et ses dérivés quniazoline et quinoléine ont produit un effet modulateur à 1 mM sur l'activité ASIC par sous-type de manière spécifique. Les guanidinopyridines ont fortement inhibé le courant de pointe à pH 5 dans ASIC1a et ASIC3 avec une puissance 20 fois supérieure à celle du GMQ. Fait intéressant, les 2guanidino-quinoléines et -pyridines ont produit un effet d'inhibition ou de potentialisation dépendant de la concentration sur le sous-type ASIC et dans les ASIC1a/2a et ASIC3/2a hétéromères, seuls quelques composés, y compris le GMQ, ont produit un petit effet modulateur sur l'activité, 2 ) Une comparaison de la mutation rare D212 dans hASIC1a qui a été utilisée dans de nombreux laboratoires comme type sauvage, avec le vrai type sauvage hASIC1a-G212 a montré une cinétique de décroissance du courant plus lente, une amplitude de courant plus élevée par canal exprimé en surface, une expression de surface accrue du canal, et cinétique de désintégration actuelle dépendante de l'anion extracellulaire dans hASIC1a-G212, et 3) en utilisant l'approche de réticulation et pour trouver une paire de résidus impliqués dans les changements de conformation lors de l'activation d'ASIC1a, les deux pinces optiques 4,4'-bis (maléimido) azobenzène (BMA) et des agents de réticulation bis-méthane-thiosulfonate (MTS) ont été appliqués. Dans hASIC1a-I428C attaché à BMA, une activation dépendante de la lumière sous une lumière de 440 nm a été observée sans la formation de la réticulation. Un effet modulateur par BMA sur une illumination lumineuse de
360 nm a été trouvé dans les mutants hASIC1a-D237C/E315C, -D237C/E355C et - K246C/D347C. Dans une seconde approche, des réticulant MTS de différentes longueurs ont été utilisés. Par rapport à la condition témoin, le traitement avec MTS-17-MTS a produit un changement acide de la dépendance au pH dans hASIC1a-D237C/I312C, et un changement alcalin ou petit acide chez les mutants simples, hASIC1a-I312C et -D237C. Une validation supplémentaire de la réticulation est requise dans D237C/I312C. Nos résultats fournissent de nouvelles informations structurelles sur l'activité ASIC1a.
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Une cellule est considérée comme un bloc l’unité de base de tout organisme vivant, et elle est composée de composants intracellulaires séparés des cellules voisines par la membrane plasmique et travaille 24 heures sur 24 pour maintenir différentes fonctions comme le support structurel, produire de l'énergie, permettre le transport passif et actif de divers ions et molécules, la gestion des réactions métaboliques et la respiration. Pour l’important échange d'ions mentionné ci-dessus, la cellule a recourt à des protéines traversant la membrane cellulaire et qui possèdent un pore sélectif permettant le passage des ions : les « canaux ioniques ». Ces canaux ioniques contrôlent divers processus biologiques comme la fonction cardiaque, la contraction des muscles squelettiques et lisses, le transport épithélial, etc. Le canal ionique peut être activé par un ligand, une tension électrique et mécaniquement. Dans notre recherche, nous travaillons avec des canaux ioniques sensibles à l'acide (ASIC) qui sont activés par acidification extracellulaire et localisés dans les neurones. Lorsqu'ils sont activés, ils sont parfois fermés ou ouverts, le passge d’ions qu’ils entrainent active les neurones. Ils sont impliqués dans diverses conditions physiopathologiques comme la douleur, les démangeaisons, l'apprentissage et la mémoire, l'épilepsie, les accidents vasculaires cérébraux, la maladie d'Alzheimer etc. On ne sait pas comment l'acidification extracellulaire peut activer le canal et quels sont les changements conformationnels associés dans ces domaines ? En mettant l'accent sur l'identification du mécanisme d'activation du canal, j'ai trouvé que 1) certaines petites molécules dérivées d'une molécule existante appelée 2-guanidine-4-méthylquinazoline (GMQ) peuvent moduler l'activité ASIC, 2) ont caractérisé une mutation rare dans l'ASIC1a humaine clone, ayant des propriétés légèrement modifiées par rapport à l'ASIC1a humain de type sauvage réel, 3) Les composés de liaison croisée, à savoir le 4,4'-bis (maléimido) azobenzène (BMA), est un composé qui peut se fixer à ses deux extrémités à un résidu cystéine modifié dans l'ASIC1a et exercer une force mécanique sur les domaines en étendant ou en pliant son forme par application d'une longueur d'onde spécifique de la lumière. Les composés à base de bis-méthane-thiosulfonate (MTS) sont de différentes longueurs qui peuvent également se fixer aux deux extrémités au résidu de cystéine modifié sans changer de forme. Les deux composés ont affecté l'activation de l'ASIC1a. Une enquête plus approfondie est nécessaire pour conclure les changements de conformation dans les domaines identifiés pendant l'activation du canal. Dans l’ensemble, plusieurs aspects associés à la relation structure-fonction de l'activité ASIC1a ont été identifiés. À l'avenir, les études présentées dans cette thèse seront utiles pour concevoir des molécules thérapeutiques en mesure d’inhiber ou d’activer le canal.
Création de la notice
04/05/2021 11:51
Dernière modification de la notice
07/05/2021 7:08
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