Hepatitis E virus (HEV) infection is a major cause of acute hepatitis worldwide. HEV genotype (gt) 1 and 2 are transmitted through the fecal-oral route and cause primarily waterborne epidemics, whereas zoonotic HEV gt 3 and 4 are transmitted via contaminated food. The infection is generally self-limited but can persist and lead to chronic hepatitis in immunocompromised patients when caused by gt 3. HEV is a small positive-strand RNA virus whose genome harbours 3 open reading frames (ORF): ORF1 encodes the viral replicase, ORF2 the viral capsid and ORF3 a small protein involved in virion secretion likely via the exosomal pathway. HEV replication is poorly understood as there is still a lack of characterization of the replicase ORF1 and of the host factors involved. Therefore, our study aims at (i) identifying host factor involved in HEV replication and (ii) further studying ORF1 protein and its involvement in replication as well as in other steps of the viral life cycle. First, to find host factors important for HEV replication, we took advantage of a recently described human activity-optimized CRISPR knockout library consisting of a pool of lentiviral constructs allowing guide RNA and Cas9 nuclease co-expression and targeting 19,050 human genes. To select for cells that are incapable of replicating HEV due to the CRISPR-Cas9-mediated knockout of an essential host factor, we have constructed subgenomic HEV gt 3 replicons harbouring a herpes simplex virus thymidine kinase gene either alone (HEV83-2_HSV-TK) or together with a neomycin resistance gene (HEV83-2_TK-Neo). Cells replicating these viral RNAs become sensitive and die as a consequence of treatment with ganciclovir. Using these tools, two different screening methods were developed and performed. Candidate genes were subsequently validated using single gene knockout and siRNA-mediated knockdown in HEV replication and infection assays. Preliminary replication assay indicates a potential involvement of RAB5A in HEV replication for which further characterization is ongoing. Second, to better characterize ORF1 protein and its role in the HEV life cycle, we conducted structure-function analyses of a conserved a-helix located in the thumb sudomain of the RNA­ dependent RNA polymerase domain. The three-dimensional structure obtained by nuclear magnetic resonance confirmed an a-helical folding and revealed an amphipathic character. Subgenomic replicons as well as full-length genomes harbouring mutations in the a-helix were used to analyze viral RNA replication and infectious particle production, respectively. These studies revealed a dual role of this_ ORF1 domain in both viral RNA replication and infectious particle production. Altogether, the identification of host factors required for HEV replication as well as the .better characterization of ORF1 protein yields new insights into the HEV life cycle and may potentially identify new angles for therapeutic intervention.
--
L'infection par le virus de l'héptite E (VHE) est une cause majeure d'hépatite aiguë dans le monde. Les génotypes (gt) 1 et 2 du VHE sont transmis par voie féco-orale et causent principalement des épidémies liées à l'eau, alors que les gt 3 et 4 sont transmis via la nourriture contaminée. L'infection est généralement spontanément résolutive mais peut persister et conduire à une hépatite chronique chez les patients immuno-supprimés infectés par le gt 3. Le VHE est un petit virus à ARN simple brin positif dont le génome comporte 3 cadres ouverts de lecture (open reading frame, ORF): ORF1 encode la réplicase, ORF2 la capside et ORF3 une petite protéine impliquée dans la sécrétion des virions probablement par la voie exosomale. La réplication du VHE est très peu connue à cause du manque de caractérisation d'ORF1 et des facteurs hôtes impliqués. Notre étude a donc pour but (i) d'identifier les facteurs hôtes impliqués dans la réplication du VHE et (ii) d'étudier plus précisément ORF1 et son implication dans la réplication ainsi que dans les autres étapes du cycle de vie du virus. Pour trouver les facteurs hôtes importants pour la réplication du VHE, nous avons utilisé une librairie CRISPR knockout (KO) qui consiste en un pool de constructions lentivirales permettant la co­ expression d'un ARN guide et de la nucléase Cas9, et ciblant 19'050 gènes humains. Pour sélectionner les cellules incapables de répliquer le VHE à cause du KO d'un facteur hôte essentiel, nous avons construit un réplicon sous-génomique du gt 3 du VHE qui exprime un gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex, soit seul (HEV83-2_HSV-TK), soit avec un gène de résistance à la néomycine (HEV83-2_TK-Neo). Les cellules répliquant ces ARNs deviennent sensibles au traitement par le ganciclovir et meurent. En utilisant ces outils, 2 stratégies différentes de criblage ont été développées et réalisées. Les gènes candidats ont été ensuite validés en interférant individuellement avec l'expression de ces gènes, grâce au CRISPR ou siRNA, dans des tests de réplication et d'infection. Les tests préliminaires de réplication suggèrent un rôle de RAB5A, dont une caractérisation plus approfondie est en cours. Ensuite, dans le but de mieux caractériser la protéine ORF1, nous avons analysé la structure et fonction d'un segment localisé dans le domaine de l'ARN polymérase dépendante de l'ARN dont la prédiction structurale en hélice-a est conservée. La structure tridimensionnelle obtenue par résonnance magnétique nucléaire a confirmé la conformation en hélice-a et a révélé son caractère amphipathique. Des réplicons sous-génomiques ainsi que des génomes entiers portant des mutations dans cette hélice-a ont permis de mettre en évidence une implication de la polymérase dans la réplication de l'ARN viral mais aussi dans la production de particules infectieuses. Finalement, l'identification des facteurs hôtes requis pour la réplication du VHE ainsi qu'une meilleure caractérisation de la protéine ORF1 amènent de nouveaux éléments pour la compréhension du cycle de vie du VHE et pourraient potentiellement permettre d'identifier de nouveaux angles thérapeutiques.