Hemostasis allows the blood to circulate as a fluid, maintaining an equilibrium between pro-coagulant and anticoagulant agents in the blood vessels. In case of an injury, hemostasis promotes localized clot formation, sealing the damaged vessel and limiting blood loss. Hemophilia is a bleeding disorder in which the absence of a specific coagulation factor impairs clot formation. Deficiency in factor VIII (FVIII) or in factor IX (FIX) causes hemophilia A (HA) or hemophilia B (HB), respectively. Current therapies require the administration of the missing coagulation factor. Inhibitory alloantibodies developed by the patient against the administered products can dampen this therapy, thus new treatments are needed. Hemophilia is a pathological state due to a disequilibrium in favor of unbalanced anticoagulant forces, thus targeting the anticoagulant system in a hémophilie context could rebalance hemostasis. Protein S (PS) is an important natural anticoagulant circulating in blood, and its deficiency increases the risk of developing thrombosis. A possible rebalance of hemostasis in hemophilia could be achieved by PS blockage. A mouse model of PS deficiency is available, where homozygous PS deficiency causes embryonic lethality while heterozygous PS deficiency increases the risk of developing thrombosis if challenged in a venous thromboembolism (VTE) model. To verify the hypothesis that targeting protein S could rebalance hemostasis in hemophilia, hémophilie mice (F8-/- or F9-/-) have been crossed with PS heterozygous deficient mice (Pros1+/-). To date, no viable Pros1-/- mouse has ever been observed. The loss of FVIII or FIX activity rescued the embryonic lethal phenotype of mice deficient in PS. Hémophilie Pros1-/- mice appeared normal, and did not display overt disseminated intravascular coagulation (DIC) signs. We demonstrated that we could imbalance hemostasis in mice lacking PS through repeated FVIII injection and cause DIC. In a VTE model, F8-/- Pros1-/- mice died earlier compared to F8-/- Pros-+-+. Résistance to activated protein C and increased thrombin generated in these mice are the cause of their earlier mortality.
We challenged F8-/- Pros1-/- with two différent tail clipping models. Bleeding was reduced in F8-/- Pros1-/- mice compared to F8-/- Pros1+/+ in both models. The improvement was due to increased fibrin network structure and density. A model of acute hemarthrosis to mimic hémophilie hemarthrosis was performed. Réduction of acute hemarthrosis, measured as joint swelling, was observed in F8-/- or F9-/- Pros1-/- mice compared to F8-/- or F9-/- 'Pros1+/+. Two mechanisms are responsible for the improved outeome. We showed that murine joint synoviocytes express PS and tissue factor pathway inhibitor (TFPI), a natural anticoagulant whose activity is enhanced by PS.
Therefore, a local hemostatic effect is most probably due to an inhibition of TFPI cofactor activity. Moreover, we demonstrated that F8-/- Pros1-/- macrophages engulf red blood cells (RBCs) more efficiently compared to F8-/- Pros1+/-. The increased phagocytic capacity could explain the decreased RBCs observed in F8-/- Pros1-/- knee joints.
PS and growth arrest-specific gene 6 (Gas6) are Tyro, Axl and Mer (TAM) ligands. TAM activation also exerts immunomodulatory function, so we wondered whether PS absence could cause an exaggerated inflammatory response. F8-/- Pros1-/- mice were screened for inflammatory and infectious complications. No increased mortality compared to F8-/- Pros1+/+ was observed despite using two différent models, (cecal ligation puncture (CLP), and lipopolysaccharide (LPS) injection to induce endotoxemia). Finally, normalization of thrombin génération by PS inhibition in vitro was observed in severe HA patients irrespective of their inhibitor titer or previous treatments. We detected PS and TFPIa in the joints of hémophilie mice, and we confirmed their détection also in human joints. In particular, PS and TFPI expression were stronger in hémophilie patients treated after a bleeding episode (on demand), compared to hémophilie patients regularly treated (on prophylaxis). Our findings demonstrate that targeting PS could constitute a new way to treat hemophilia and as human joints express PS this product could be administered also subcutaneously.
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Pour que le sang puisse circuler en tant que fluide, l'hémostase, c'est-à-dire l'équilibre entre les procoagulants et anticoagulants doit être régulée dans les vaisseaux sanguins. En cas de blessures, l'hémostase favorise la formation localisée du caillot afin de sceller le vaisseau endommagé et de limiter la perte de sang. L'hémophilie est un trouble de l'hémostase dans lequel l'absence d'un facteur de coagulation spécifique entrave la formation du caillot. Les déficits en facteurs VIII (FVIII) ou en facteur IX (FIX) sont responsables respectivement de l'hémophilie A (HA) et de l'hémophilie B (HB). Les thérapies actuelles consistent en l'administration du facteur de coagulation déficitaire. Cependant des alloanticorps inhibiteurs développés par le patient contre les produits administrés pouvent freiner cette thérapie, de nouvelles approches thérapeutiques sont nécessaires. L'hémophilie étant un état pathologique dû à un déséquilibre en faveur des forces anticoagulantes, inhiber le système anticoagulant dans le contexte de l'hémophilie pourrait rééquilibrer l'hémostase. La protéine S (PS) est un anticoagulant naturel important circulant dans le sang et son déficit augmente le risque de développer une thrombose. Un rééquilibre de l'hémostase dans l'hémophile pourrait être réalisé en bloquant la protéine S. Un modèle de souris du déficit en PS est disponible, où le déficit en PS homozygote provoque une létalité embryonnaire et le déficit hétérozygote augmente le risque de développer une thrombose une fois la souris soumise à un modèle de thromboembolie veineuse (TEV). Pour vérifier cette hypothèse, les souris hémophiles (F8/_ ou F9V") ont été croisées avec les souris avec un déficit hétérozygote pour la PS (Pros1+/~). À ce jour, aucune souris ProsTviable n'a été décrite. Le perte de l'activité du FVIII ou du FIX va sauver les souris déficientes en PS du phénotype létal embryonnaire. Les souris hémophiles ProsT'' paraissent normales et ne présentent pas de signe de coagulation intravasculaire disséminée (CIVD). Nous avons démontré que nous pouvons déséquilibrer l'hémostase chez les souris déficientes en PS en injectant de manière répétée du FVIII, provoquant ainsi une CIVD. Dans un modèle de TEV, les souris F8V" ProsTA meurent plus rapidement que les souris F8V" Pros1+/+. La résistance à la protéine C activée et l'augmentation de la thrombine générée (en raison d'une inhibition de l'activité cofactoriale de l'inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI)) dans ces souris sont les causes de cette mortalité précoce.
Nous avons soumis les souris F8V" ProsTA à deux modèles différents de transsection de la queue « tail clipping ». Le saignement a ainsi été réduit chez les souris F8V' ProsTA par rapport aux souris F8A Pros1*/+ dans les deux modèles. Cette amélioration est due à l'augmentation de la densité de la structure du réseau de fibrine. Un modèle d'hémarthrose aiguë a été réalisé pour imiter l'hémarthrose hémophilique. Une réduction de l'hémarthrose aiguë, évaluée par la mesure de l'enflure de l'articulation, a été observée chez les souris FB* Prosl ' ou F9~'~ Prosl"A par ra'pport aux souris F8"A Pros1+/+ ou F9"A Pros1+/+. Deux mécanismes sont responsables de l'amélioration des résultats. Nous avons montré que les synoviocytes des articulations murines expriment la protéine S et TFPI, un anticoagulant naturel dont l'activité est renforcée par la PS. Par conséquent, l'effet hémostatique local est très probablement du à une inhibition de l'activité de la PS en tant que cofacteur du TFPI. De plus, nous avons démontré que les macrophages F8A ProsVA phagocytent les globules rouges de façon plus efficace par rapport aux macrophages F8A ProsV'-.
Cette capacité phagocytaire accrue pourrait expliquer la diminution du nombre des globules rouges observé dans les articulations des genoux chez les souris F8A Prosl '. Les protéines PS et « growth arrest-specific gene 6 » (Gas6) sont des ligands de Tyro, Axl et Mer (TAM). L'activation des TAM exerce également une fonction immunomodulatrice et nous nous demandions si l'absence de PS pouvait provoquer une réponse inflammatoire exagérée. Les souris F8A Pros1+/+ ont ainsi été mises en condition d'inflammation et d'infection. Aucune augmentation de la mortalité par rapport aux souris F8"A Pros1+/+ n'a été observée malgré l'utilisation de deux modèles différents (la ligature et la ponction caecale, (LPC), et l'injection de lipopolysaccharide, (LPS)), pour induire une endotoxémie. Enfin, une normalization de la génération de thrombine via l'inhibition de la PS in vitro a été observée chez un patient avec inhibiteur de HA. Nous avons détecté PS et TFPIc dans les articulations de souris hémophiles, et nous avons confirmé leur détection dans les articulations humaines. En particulier, l'expression de PS et de TFPI était plus forte chez les patients hémophiles traités après un épisode de saignement (Traitement sur demande), comparativement aux patients hémophiles traités régulièrement (Traitement prophylactique). Nos résultats démontrent pour la première fois que l'inhibition de la PS pourrait traiter l'hémophilie. Comme les articulations humaines expriment la PS ce produit pouvaient être administré par voie sous-cutanée.