In mammals, the 5’ methylation of the cytosine base (5mC) in the genomic DNA is intimately linked
with the regulation of gene expression. Despite its stability and heritability across cell division, 5mC
erasure is required for the activation of developmental programs associated with extensive
functional reprogramming. Once deposited in the genome, 5mC can be removed either through
passive dilution during DNA replication, or through active mechanisms characterized by enzymatic
oxidation of the methyl mark to 5’-hydroxymethylcytosine (5hmC), which can persist as such or
undergo further oxidation and enzymatic removal. However, it is still unclear what is the relative
contribution of each mechanism to the epigenetic control in evolving biological systems. Therefore,
the overall aim of this thesis is to investigate the contribution of active and passive mechanisms to
5mC and 5hmC removal in a cellular system. To explore this critical issue we used primary human T
helper (TH) lymphocytes, in which two cellular states can be clearly identified: quiescent naive T cells,
which are slowly or rarely proliferating, and rapidly proliferating activated T cells upon antigen
recognition. First, we found that the 5hmC is dynamically modulated during T cell activation, indeed
unstimulated naive T cells maintained higher levels of 5hmC compared to those of all other antigenexperienced
T lymphocytes, highlighting that DNA demethylation is a process linked to the activation
and not to specific effector T cell subsets. Using compounds that inhibit methylation or enhance
demethylation, we found an increased ability of the cells to produce effector cytokines, suggesting
that DNA methylation-related processes are required for the efficient differentiation of T cells to
effector and memory subsets. By optimizing methods to uncouple T cell activation from proliferation,
naive T lymphocytes showed a significant loss of genomic 5hmC upon activation, even in the
complete absence of proliferation. These results point towards a role for active processes of DNA
demethylation in the first activation of naive T cells. On the other hand replication-dependent
dilution was the driving force leading to 5hmC reduction in highly proliferative and already
differentiated cells. Finally, by analyzing genome-wide DNA methylation and hydroxymethylation we
found that these modifications change dynamically during T cell activation, and 5hmC in particular
appeared to be differentially associated with regulatory regions of early and late response immune
genes. Our data suggest that the usage of active vs. passive mechanisms of DNA demethylation is
differentiation and activation stage-dependent. Specifically, active demethylation mechanisms are
selectively involved in quiescent naive T lymphocytes prior to cell-cycle entry to maintain regulatory
regions poised for rapid responses to physiological stimuli, while passive, replication-dependent
dilution of the modified cytosines primarily is at work in memory T lymphocytes.
--
Chez les mammifères, la méthylation en 5’ de la base cytosine (5mC) de l’ADN génomique est
intimement liée à la régulation de l’expression des gènes. Malgré sa stabilité et son héritabilité au
cours des divisions cellulaires, la suppression de 5mC est requise pour l’activation de programmes de
développement. Une fois déposée sur le génome, 5mC peut être éliminée soit par dilution passive
lors de la réplication de l’ADN soit par des procédés actifs caractérisés par l’oxydation enzymatique
du groupe méthyl générant la 5’-hydroxyméthylcytosine (5hmC) qui peut persister en tant que tel ou
bien subir ultérieurement oxydation et élimination enzymatique. Toutefois, la contribution relative
de chacun de ces mécanismes dans le contrôle épigénétique des systèmes biologiques évolutifs
demeure incertaine. Dès lors, l’objectif de cette thèse est d’étudier la contribution des mécanismes
actifs et passifs de la suppression de 5mC et 5hmC dans un système cellulaire. A cette fin, nous avons
utilisé des lymphocytes humains T « helper » (TH) primaires dans deux états cellulaires distincts: les
cellules T naives quiescentes proliférant rarement ou très lentement et les cellules T activées par
l’antigène et proliférant vigoureusement. Nous avons établi que la 5hmC est dynamiquement
modulée durant l’activation des cellules T, les cellules naives non stimulées maintenant des niveaux
de 5hmC plus élevés que ceux de tous les autres lymphocytes T ayant rencontré leur antigène,
mettant ainsi en évidence que la déméthylation de l’ADN est un procédé lié à l’activation et non pas
à une sous-population de cellules T effectrices spécifiques. Grace à des composés inhibant la
méthylation ou augmentant la déméthylation, nous avons pu montrer une capacité accrue des
cellules à produire des cytokines effectrices, suggérant ainsi que les procédés relatifs à la méthylation
de l’ADN sont requis pour une différentiation efficace des cellules T effectrices et mémoire. Après
optimisation des méthodes pour découpler l’activation de la prolifération, les lymphocytes T naifs
ont montré une perte significative de la 5hmC génomique lors de l’activation et ce même en totale
absence de prolifération, pointant vers un rôle des procédés actifs de déméthylation lors de
l’activation des cellules T naives. D’autre part, la dilution dépendant de la réplication de l’ADN est le
procédé principal menant à la réduction de la 5hmC pour les cellules hautement prolifératives et déjà
différenciées. Enfin, en analysant l’entier du génome, nous avons découvert que ces modifications
sont dynamiques durant l’activation des cellules T et que 5hmC en particulier semble être associée à
des régions régulatrices de gènes de la réponse immunitaire initiale. Nos résultats suggèrent que
l’usage des mécanismes actifs vs passifs de la déméthylation de l’ADN dépend de l’état d’activation
et de différentiation. Plus précisément, les mécanismes actifs sont impliqués sélectivement chez les
lymphocytes T naïfs avant l’entrée dans le cycle cellulaire afin de maintenir les régions régulatrices
prêtes pour une réponse rapide alors que la dilution passive des cytosines modifiées dépendant de la
réplication opère principalement chez les lymphocytes T mémoire.