Eukaryotic genomes are compartmentalized in different structural domains that can affect positively or negatively gene expression. These regions of euchromatin and heterochromatin are characterized by distinct histones marks which can facilitate or repress gene transcription. The chromatin environment represents thus one of the main problems to control gene expression in biotechnological applications or gene therapy, since its expression is affected by the chromatin neighboring its locus of insertion. Some chromatin regions like telomeres are composed of constitutive heterochromatin which leads to the telomeric position effect (TPE) that silences genes adjacent to the telomere. TPE is known to spread by the selfrecruitment of the SIR histone deacetylase complex from the telomere in S.cerevisiae, but the histone marks that are associated to telomeric chromatin in mammalian cells remain mostly unknown. The transcription factor CTF1 has shown antisilencing properties in mammalian cells and also a boundary activity against TPE in yeast cells when fused to the yeast Gal4 DNA binding domain. In the work presented here, we describe a dual-reporter system to assess the boundary activity of proteins such as CTF1 at human telomeres. When located between the two reporter genes, CTF1 shields the telomere distal gene from TPE, while the telomereproximal gene remains silenced by telomeric heterochromatin. The boundary activity of CTF1 is shown to act regardless its function of transcriptional activator, by opposition to the transcriptional activator VP16 which activates indifferently both transgenes. Moreover, this study shows that CTF1 boundary activity is linked to its H3 binding function, as expected from a chromatin remodeler. ChIP experiments showed that histone deacetylation is the main histone modification involved in gene silencing at mammalian cell telomeres. Distinctly to yeast cells, the histone deacetylation signal in human cells extented over a short range along the chromosome. CTF1 may help to block this propagation and therefore to restore histones acetylation level on telomere protected locus. Surprisingly, other histone marks such as trimethyl-H3K9 or trimethyl-H4K20 were found on telomere protected locus, while in another clone, unsilencing of telomere distal transgene was associated with recruitment of the histone variant H2A.Z. Thus, I conclude that CTF1 displays a chromatin boundary function which is independent of its transcriptional activity and therefore exhibit features required for use as chromatin insulator in biotechnological applications.
RESUME
Les génomes eucaryotes sont compartementalisés en domaines structurels qui peuvent
affecter positivement ou négativement l'expression des gènes avoisinants. Ces régions dites
d'euchromatine ou d'hétérochromatine sont caractérisées par des modifications posttraductionnelles
des histones qui peuvent faciliter ou au contraire inhiber la transcription des
gènes qui s'y trouvent. Ainsi, isoler un gène de son environnement chromatinien est problème
fréquent lorsqu'il s'agit de contrôler son expression dans le cadre d'applications en
biotechnologie ou encore en thérapie génique. Certaines régions de chromatine telles que les
télomères sont composées d'hétérochromatine constitutive qui mène au silençage des gènes
avoisinants. Cet effet de position télomérique (TPE) est connu dans la levure S.cerevisiae
comme se propageant par auto-recrutement du complexe de déacétylation d'histone SIR, alors
que peu de modifications de chromatine ont pu être associées à ce phénomène dans les
cellules de mammifères.
Le facteur de transcription CTF1 a montré des propriétés d'anti-silençage dans les
cellules de mammifères, ainsi qu'une activité barrière contre le silençage télomérique dans les
cellules de levures lorsqu'il est fusionné au domaine de liaison à l'ADN de la protéine de
levure Gal4. Dans le travail présenté ci-après est décrit un système à deux gènes rapporteurs
permettant de mesurer l'activité barrière de protéines telles que CTF1 aux télomères humains,
et les modifications de chromatine qui y sont associées. Lorsque CTF1 est placé entre les
deux gènes rapporteurs, le gène distant du télomère est protégé du silençage qui lui est
associé, alors que le gène proche du télomère reste soumis à ce silençage induit par
l'hétérochromatine télomérique. L'activité barrière de CTF1 est montrée ici comme agissant
indépendamment de son activité transcriptionnelle, par opposition à l'activateur
transcriptionnel VP16 qui active indifféremment les deux transgènes. En outre, cette étude
appuie l'hypothèse stipulant que CTF1 agisse comme remodeleur chromatinien puisqu'elle
démontre que son activité barrière est directement dépendante de son activité de liaison avec
l'histone H3.
De plus, des expériences d'immuno-précipitation de la chromatine démontrent que la
déacétylation des histones est le majeur phénomène intervenant dans le silençage télomérique.
Par opposition à la levure, ce signal de déacétylation ne se propage dans les cellules humaines
que sur une courte distance le long du chromosome. CTF1 agit ainsi en bloquant cette
propagation et en restaurant le niveau d'acétylation des histones sur le locus protégé du
télomère. De manière surprenante et inattendue, d'autres modifications d'histones telles que
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les H3K9 et H4K20 triméthylées sont aussi observées à ce locus, tandis le recrutement du
variant H2A.Z peut aussi être suffisant à restaurer l'expression du gène distant du télomère.
En terme de cette analyse, CTF1 exhibe ainsi une fonction de barrière chromatinienne
qui exclue une activité transcriptionnelle non désirée - propriété qui est requise dans
l'établissement des isolateurs visant à permettre le contrôle d'un transgène dans le cadre
d'applications en biotechnologies.