The epithelium sodium channel (ENaC) consists of the a, (3, and yENaC subunits that are expressed at the apical side of tight epithelia in the kidney, and is limiting for sodium reabsorption. Mutations in ENaC subunits are causative for the human disease namely, the pseudohypoaldosteronism type 1 (PHA-1), a salt-losing syndrome. Since mice with a ubiquitous and constitutive gene inactivation of (3- and y-ENaC die soon after birth, we aimed to unveil the spécifié rôle of these ENaC subunits in the adult kidney. We generated and used 4-weeks old doxycycline induced nephron-specific p- and y-ENaC knockout mice obtained by crossing double transgenic mice (PAX8/LC1) (Traykova-Brauch, Schonig et al. 2008) with floxed Scnnlb and Scnnlg mice, respectively (Merillat, Charles et al. 2009). Under standard diet, both Scnn1bPax8/LC1 and Scnn1gPax8/LC1 mice presented a severe PHA-I like phenotype upon doxycycline induction characterized by a loss of body weight, an increase of plasma aldosterone and potassium concentrations and downregulation of NCC and SPAK expression. While the severe body weight loss and the hyperkalemia of Scnn1bPax8/LC1 mice can be restored with high sodium and low potassium or standard sodium and low potassium diets, Scnn1gPax8/LC1 mice still present a severe PHA-I phenotype. NCC and SPAK protein expression levels are only restored in Scnn1bPax8/LC1 mice.
The second part of my thesis was to generate a catalytically-inactive CAP1/Prss8 mouse model by mutating the serine 238 to alanine (S238A) through the use of Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALEN). I designed and generated TALEN pairs that exhibit a highly cutting efficiency of 32% in NIH3T3 cells. In conclusion, (3- and y-ENaC subunits are both crucial for the maintenance of sodium and potassium homeostasis in adult kidney. This study highly suggests a differential régulation of the p- and y-ENaC subunits in the adult nephron. In addition, TALEN is a potential useful tool to rapidly generate a knock-in (Kl) mouse model.
Résumé
Le canal épithélial sodique (ENaC) est composé de trois sous-unités (a, (3, and yENaC) qui sont exprimées au côté apical des tissus épithéliaux du rein. ENaC est connu pour être le facteur limitant de la réabsorption sodique. Des mutations des sous-unités ENaC sont la cause d'une maladie humaine, à savoir, le pseudohypoaldosteronism de type 1 (PHA-1), qui est un syndrome de perte de sel. Puisque les souris avec une inactivation génique omniprésente et constitutivement exprimée des sous-unités (3- et y-ENaC meurent peu de temps après la naissance, notre but est d'étudier leurs rôles spécifiques dans le rein adulte. Nous avons généré et utilisé des souris « knock-out » spécifique pour le néphron et les avons induites par la doxycycline à l'âge de 4 semaines. Nous avons obtenu les souris en croissant la ligné de souris doublement transgénique (PAX8/LC1) avec soit la ligné floxée Scnnlb ou celle floxée Scnnlg. Les souris Scnn1bPax8/LC1 et Scnn1gPax8/LC1 présentent, une fois induites et sous diète standard, un phénotype de type PHA-I, caractérisée par une perte de poids, une augmentation de la concentration de l'aldostérone et du potassium plasmatique, et d'une réduction de l'expression de NCC et de SPAK. Alors que la perte de poids et l'hyperkaliémie peuvent être rétablies chez les souris Scnn1bPax8/LC1 sous une diète possédant soit de forte concentration de sodium et de faible concentration de potassium, ou une concentration normale de sodium mais une faible concentration de potassium, les souris Scnn1gPax8/LC1 quant à elle présentent encore un sévère phénotype de type PHA-I. L'expression protéique de NCC and de SPAK peut être rétablie seulement chez souris Scnn1bPax8/LC1.
La deuxième partie de ma thèse était de générer une lignée de souris composée d'un site catalytique inactive de CAP1, en mutant la sérine 238 en alanine (S238A) et par l'utilisation de nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN). J'ai dessiné et généré des paires de TALEN, qui possèdent une grande efficacité de coupage de l'ordre de 32% dans les cellules NIH3T3. En conclusion, les sous-unités (3- et y-ENaC sont essentielles dans le rein adulte pour maintenir la balance sodique et potassique. Cette étude suggère fortement une régulation différentielle des sous unités (3 et yENaC dans le néphron adulte. En outre, la technologie des TALEN est un bon outil pour générer rapidement un modèle de souris « knock-in (Kl) ».