Revealing the molecular logic of cerebellar development and connectivity

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State: Public
Version: author
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Serval ID
serval:BIB_8D763B3AA3F4
Type
PhD thesis: a PhD thesis.
Collection
Publications
Institution
Title
Revealing the molecular logic of cerebellar development and connectivity
Author(s)
Xiong Bilian
Director(s)
Telley Ludovic
Institution details
Université de Lausanne, Faculté de biologie et médecine
Publication state
Accepted
Issued date
19/01/2024
Language
english
Abstract
The cerebellum is composed of two parts: the cerebellar cortex and the cerebellar nuclei. The first project of this thesis investigated the development of GABAergic interneurons in the cerebellar cortex, which are important inhibitory modulators for the Purkinje cell firing. GABAergic interneurons derive from Pax2 progenitors and are specified into diverse mature interneurons in different layers of the cerebellar cortex molecular layer and granule cell layer. Previous studies have implicated Neurod2, a transcription factor, in the development of GABAergic interneurons, with its deficiency leading to developmental anomalies and absence of certain interneuron subtypes. However, how Neurod2 is involved in the differentiation of GABAergic interneurons is still unclear. To answer this question, we first revealed the Neurod2 expression in embryonic stages with immunohistochemistry combined with Flashtag labeling, revealing its involvement in the development of GABAergic interneurons from an early age. Additionally, we used immunohistochemistry combined with single-nucleus RNA sequencing (snRNAseq) to examine interneuron development and molecular differences in wild-type versus Neurod2-/- mutant mice. We observed a consistent absence of mature basket cells and stellate cells, accompanied by a notable increase in Pax2+ cells within the molecular layer of mutant mice from perinatal ages to adulthood. Interestingly, in adult mutant mice, these Pax2+ cells in the molecular layer expressed the Golgi cell marker Neurogranin. This suggests that these ectopic cells in mutant mice developed along an alternative path, possibly supporting the persistence of GABAergic synapses within the molecular layer. SnRNAseq of both wild-type and mutant cerebella revealed a transcriptomic change with a new state of GABAergic interneurons at the interface along typical molecular layer interneurons (basket and stellate cells) and Golgi cells. Together, our findings reveal a critical role for Neurod2 in the control of fate restriction of GABAergic interneurons.
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The second project shifts focus to the cerebellar nuclei (CN), which are the ultimate output of the cerebellum, known to be involved in both motor and non-motor functioning. It communicates widely with extracerebellar regions. Despite growing knowledge of cerebellar heterogeneity, the specific involvement of CN subtypes in distinct pathways remains unclear. This project designed a novel neuronal tracing method, employing an anterograde monosynaptic tracer, AAV5-WGA-mCherry-barcode, to map the connectome and dissect the molecular diversity of CN neurons concurrently. We demonstrated its effective labeling of cerebellar nuclei projections, establishing its reliability and efficiency compared to existing tracers. We also validated its compatibility with fluorescence-activated nuclei sorting and single-cell transcriptomic protocols. Altogether, our results suggest that AAV5-WGA- mCherry-barcode is a promising high-throughput anterograde monosynaptic tracer for mapping the full connectome of cerebellar nuclei.
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Le cervelet est composé de deux parties, le cortex cérébelleux et les noyaux cérébelleux. Le premier projet de cette thèse a étudié le développement des interneurones GABAergiques dans le cortex cérébelleux, qui sont d'importants modulateurs inhibiteurs pour la modulation des cellules de Purkinje. Les interneurones GABAergiques dérivent des progéniteurs Pax2 et se spécialisent en divers interneurones matures dans différentes couches du cortex cérébelleux, les couches moléculaires et granulaires. Des études antérieures ont impliqué le rôle du fasteur de transcription Neurod2 dans le développement des interneurones GABAergiques et que son déficit aboutit à des anomalies du développement cérébelleux ainsi qu’a l'absence de certains sous-types d'interneurones. Cependant, la manière dont Neurod2 intervient dans la différenciation des interneurones GABAergiques reste inexploré. Pour répondre à cette question, nous avons d'abord étudié l'expression de Neurod2 aux stades embryonnaires avec l'immunohistochimie combinée au marquage Flashtag, révélant ainsi son implication précoce dans le développement des interneurones GABAergiques. De plus, nous avons utilisé l'immunohistochimie combinée au séquençage d'ARN sur noyau unique (snRNAseq) pour examiner le développement des interneurones et les différences moléculaires chez les souris sauvages par rapport aux souris mutantes Neurod2-/-. Nous avons observé une absence constante de « Basket cells » et « Stellate cell », accompagnée d'une augmentation notable du nombre de cellules PAX2+ dans la couche moléculaire des souris mutantes, de l'âge périnatal à l'âge adulte. De plus, chez les souris mutantes adultes, ces cellules PAX2+ localisées dans la couche moléculaire, présentent des changements morphologiques et expriment le marqueur des cellules de Golgi Neurogranin. Cela suggère que ces cellules ectopiques chez les souris mutantes se sont développées selon une voie cellulaire alternative, permettant le maintien des synapses GABAergiques dans la couche moléculaire. Enfin, le snRNAseq des cervelets sauvages et mutants a révélé un changement transcriptomique important, avec l’apparition d’un nouvel état cellulaire de neurones GABAergiques qui se retrouve à l'interface entre les interneurones typiques de la couche moléculaire (« Basket cells » et « Stellate cell ») et les cellules de Golgi. Ensemble, nos résultats révèlent un rôle crucial de Neurod2 dans le contrôle de la restriction du devenir des interneurones GABAergiques.
Le second projet se concentre sur les noyaux cérébelleux (NC), qui représentent les efférences ultimes du cervelet, connus pour être impliqués dans des fonctions motrices et non motrices. Les NC communiquent largement avec de nombreuses régions cérébrales. Malgré une connaissance croissante de l'hétérogénéité cérébelleuse, l'implication spécifique des sous- types de NC dans la connectivité cérébelleuse reste inconnue. Ce projet consiste en la création d’une nouvelle méthode de traçage neuronal, utilisant un traceur monosynaptique antérograde, AAV5-WGA-mCherry-barcode, pour cartographier le connectome et disséquer en parallèle la diversité moléculaire des neurones NC. Au cours de cette thèse, nous avons démontré la fonctionnalité de cet outil, en établissant sa fiabilité et son efficacité par rapport aux traceurs conventionnels. Nous avons en outre validé sa compatibilité avec le tri des noyaux activés par fluorescence et les protocoles transcriptomiques sur noyau unique. Dans l'ensemble, nos résultats suggèrent que AAV5-WGA-mCherry-barcode est un traceur monosynaptique antérograde très prometteur pour cartographier le connectome complet des noyaux cérébelleux.
Create date
24/01/2024 12:18
Last modification date
14/03/2024 13:51
Usage data