Development of blood steroid profiling for the detection of testosterone doping

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State: Public
Version: After imprimatur
License: Not specified
Serval ID
serval:BIB_46FAEFBA3DD8
Type
PhD thesis: a PhD thesis.
Collection
Publications
Institution
Title
Development of blood steroid profiling for the detection of testosterone doping
Author(s)
PONZETTO Federico
Director(s)
Saugy Martial
Codirector(s)
Rudaz Serge
Institution details
Université de Lausanne, Faculté de biologie et médecine
Publication state
Accepted
Issued date
2019
Language
english
Abstract
La testostérone, ainsi que ses analogues synthétiques, est utilisée pour l’amélioration des performances sportives depuis les premières décennies du 20ème siècle et représente toujours l’une des substances les plus détectées par les laboratoires antidopage. Elle a la capacité d’augmenter la performance sportive en induisant une augmentation de la masse musculaire et de la force. De plus, elle est utilisée par les athlètes afin d’améliorer leur récupération. Dans le contexte de l’antidopage, l’abus de testostérone est détecté depuis 2014 à l’aide du “module stéroïdien” du Passeport Biologique de l’Athlète. Ce module stéroïdien consiste en un suivi longitudinal de 5 ratios des concentrations urinaires de stéroïdes anabolisants androgènes endogènes (SAAE). Bien que cette approche ait significativement amélioré les capacités de détection du dopage à la testostérone, elle reste soumise à divers inconvénients, principalement liés à la nature des échantillons urinaires analysés et à la méthode employée pour les analyses. Le but de la thèse a été d’évaluer la faisabilité d’un passage de l’urine au sang comme matrice d’échantillon pour détecter le dopage à la testostérone, en développant des stratégies analytiques alternatives pour la mesure des concentrations de SAAE dans le sérum, et en vérifiant si cette approche était capable d’augmenter les performances du profil stéroïdien urinaire actuel. Une première étude, dans laquelle un suivi longitudinal des concentrations sériques de testostérone et de son métabolite majeur, la dihydrotestostérone, a été effectué, a montré que cette nouvelle approche pouvait apporter des informations complémentaires au module stéroïdien actuel, en ce qui concerne notamment la détection de l’administration transdermique de testostérone. Par conséquent, une étude de découverte de biomarqueurs a ensuite été réalisée dans le but de mettre en évidence de nouveaux marqueurs sériques du dopage à la testostérone. Les résultats de cette recherche ont confirmé le potentiel des analyses sériques à des fins antidopage et ont souligné l’importance du suivi des métabolites glucuroconjugués et sulfoconjugués des stéroïdes pour améliorer la détection de l’administration orale de testostérone. Enfin, le développement d’une nouvelle plateforme analytique pour la mesure de tous les marqueurs de dopage à la testostérone, précédemment mis en évidence, dans des échantillons de sérum a été réalisé. Le résultat final de la thèse a été la proposition d’un panel d’hormones stéroïdiennes endogènes pouvant être mesurées dans le sérum à l’aide de la méthode d’analyse développée et pouvant représenter le point de départ de la future implémentation d’un module stéroïdien sanguin dans le Passeport Biologique de l’Athlète.
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Since 2014, testosterone (T) doping is detected thanks to the “steroidal module” of the Athlete Biological Passport. The steroidal module consists of the longitudinal monitoring of 5 ratios between endogenous anabolic androgenic steroids (EAAS) concentrations, measured by GC-MS in urine. Although this longitudinal approach improved T doping detection capabilities in comparison with the former testosterone/epitestosterone (T/E) threshold value of 4, it is still subjected to various drawbacks, mainly related to the nature of urinary matrix and the analytical technique employed for the analyses. The aim of the thesis was to develop an alternative strategy for the detection of T doping based on the measurement of EAAS concentrations in blood and capable of increasing the performance of the current urinary steroid profile. The first part of the work, presented in Chapter II, focused on the development of analytical methods for the analysis of endogenous steroids in serum. A UHPLC-MS/MS and a UHPLC-HRMS method for the quantification of endogenous steroid hormones in serum were developed and then applied to serum samples collected during a T administration clinical trial. The results of these studies highlighted the longitudinal monitoring of T and dihydrotestosterone (DHT) serum concentrations as a promising complementary approach to the current urinary steroidal module as well as the suitability of both MS/MS and HRMS platforms for steroid hormones quantification in blood. The second part of the work, presented in Chapter III, focused on the search for additional serum biomarkers of T doping by means of a more holistic approach, namely “steroidomics”. A novel protocol for untargeted UHPLC-HRMS steroidomic analyses was developed, which included detailed description of SPE-based sample preparation procedure as well as technical aspects for both chromatography and mass spectrometry analysis. Moreover, propositions of setup for sample sequence and data analysis were given together with information about the assessment of data quality and system performance. The protocol was then used, with slight modifications, to analyze T clinical trial serum samples. Raw data obtained by UHPLC-HRMS analyses were thoroughly investigated, giving high priority to the identification of detected compounds, which often represents the bottleneck step in metabolomics studies. This first serum steroidomic application in anti-doping context proved to be a useful tool for the discovery of T abuse serum biomarkers. Finally, in Chapter IV, a further UHPLC-MS/MS targeted method was developed for extended steroid profiling, which allowed the quantification of a large number of steroid hormones, including all the markers of T doping highlighted in
previous studies. This method was first used for a population study, in which estimated serum concentration ranges of all target compounds were calculated, and then applied to the analyses of samples collected from three volunteers of T administration clinical trial with the aim of confirming doping detection performance pointed out during the steroidomic study. The work presented in this thesis resulted in the proposition of a panel of endogenous steroid hormones and metabolites, which measurement in serum could give complementary information to the current urinary steroidal module and represent the starting point of a future blood steroidal module of the Athlete Biological Passport.
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Depuis 2014, le dopage à la testostérone (T) est détecté à l’aide du “module stéroïdien” du Passeport Biologique de l’Athlète. Le module stéroïdien repose sur le suivi longitudinal de 5 ratios des concentrations de stéroïdes anabolisants androgènes endogènes (SAAE), mesurées par GC-MS dans l’urine. Bien que cette approche longitudinale ait amélioré la capacité de détection du dopage à la T en comparaison à l’ancien seuil testostérone/épitestostérone (T/E) fixé à 4, il est toujours sujet à divers inconvénients, principalement liés à la nature de la matrice urinaire et à la technique analytique utilisée pour les analyses. Le but de la thèse a été de développer une stratégie alternative pour la détection du dopage à la T basée sur la mesure des concentrations de SAAE dans le sang et capable d’améliorer la performance du profil stéroïdien urinaire actuel. La première partie du travail, présentée dans le Chapitre II, se focalise sur le développement de méthodes analytiques pour l’analyse des stéroïdes endogènes dans le sérum. Deux méthodes UHPLC-MS/MS et UHPLC-HRMS pour la quantification des hormones stéroïdiennes endogènes dans le sérum ont été développées et appliquées à des échantillons de sérum collectés au cours d’un essai clinique avec administration de T. Les résultats de ces études ont mis en évidence le suivi longitudinal des concentrations sériques de T et de dihydrotestostérone (DHT) comme approche prometteuse et complémentaire au module stéroïdien urinaire actuel ainsi que la pertinence de la MS/MS et de la HRMS pour le dosage d’hormones stéroïdiennes dans le sang. La seconde partie du travail, présentée dans le Chapitre III, se concentre sur la recherche de biomarqueurs sériques supplémentaires du dopage à la T par le biais d’une approche plus holistique, à savoir la “stéroïdomique”. Un nouveau protocole pour l’analyse stéroïdomique non ciblée par UHPLC-HRMS a été développé, incluant la description détaillée de la procédure de préparation d’échantillons ainsi que des aspects techniques tant pour la chromatographie que pour la spectrométrie de masse. De plus, des propositions de séquence d’échantillons et d’analyse de données ont été présentées, de même que des informations sur l’évaluation de la qualité des données et de la performance du système. Le protocole a ensuite été utilisé, avec de légères modifications, pour analyser les échantillons sériques de l’essai clinique de T. Les données brutes obtenues par analyses UHPLC-HRMS ont été soigneusement étudiées en donnant la priorité à l’identification des composés détectés, représentant souvent l’étape limitante dans les études de métabolomique. La première application de la stéroïdomique sérique dans un contexte anti-dopage s’est avérée être un outil utile pour la découverte de nouveau biomarqueurs
sériques de l’abus de T. Finalement, dans le Chapitre IV, une nouvelle méthode UHPLC-MS/MS ciblèe a été développée pour le profilage étendu des stéroïdes, ce qui a permis de quantifier un grand nombre d’hormones stéroïdiennes, y compris tous les marqueurs du dopage à la T mis en évidence dans des études antérieures. Cette méthode a d’abord été utilisée pour une étude de population dans laquelle les intervalles de concentration sérique estimée de tous les composés cibles ont été calculés, puis appliquée aux analyses d’échantillons de sérum prélevés chez trois volontaires de l’essai clinique sur l’administration de T dans le but de confirmer la performance de détection du dopage pendant l’étude stéroïdomique. Les travaux présentés dans cette thèse ont abouti à la proposition d’un panel d’hormones stéroïdiennes et de métabolites endogènes, dont les mesures dans le sérum pourraient fournir des informations complémentaires au module stéroïdien urinaire actuel et constituer le point de départ d’un futur module stéroïdien sanguin du Passeport Biologique de l’Athlète.
Create date
19/11/2019 10:08
Last modification date
16/12/2019 10:56
Usage data