SUMMARY
Bioaugmentation uses the capacities of specific bacterial strains inoculated into sites to enhance pollutant biodegradation. Bioaugmentation mainly involves introducing bacteria that deploy their metabolic properties and adaptation potential to survive and propagate in the contaminated environment using the target pollutant as a carbon, nutrient or energy source. Most of our understanding of biodegradation activity comes from experiments carried out under laboratory conditions. However, attempts to demonstrate the potential for bioaugmentation of biodegraders under in situ conditions have shown both success and failures, without clear understanding of the underlying reasons or mechanisms. We hypothesized that a better understanding is necessary of the processes occurring during the invasion of inoculants into complex environments, such as polluted soils. Only then can we identify the bottlenecks for bioaugmentation and fully exploit the natural diversity of biodegrader candidates. In this context, the overall aim of this work was to rationally study the soil survival capacity and contrast the metabolic and physiological strategies of the BTEX-degrading bacterium Pseudomonas veronii 1YdBTEX2 during adaptation and invasion to natural non-sterile and contaminated soils, with that in polluted liquid suspended cultures or standardized porous materials.
In the general introduction, I present the state of the art in soil bioremediation and bioaugmentation, and degradation of BTEX compounds in particular.
In the first research chapter, I focus on understanding the adaptive response of P. veronii 1YdBTEX2 during transition from liquid batch culture to contaminated soil. For this, I analyzed the short-term (1 h) changes in genome-wide gene expression in non-sterile sand compared to liquid medium, both in presence or absence of toluene. In a collaborative effort, we improved the genome sequence of P. veronii 1YdBETX2, and showed that it actually covers three individual replicons with a total size of 8 Mb, with a large proportion of genes with unknown functions. One-hour exposure to toluene, both in soil and liquid, triggered massive transcription (up to 208-fold induction) of multiple gene clusters, such as toluene degradation pathway(s), chemotaxis, and toluene efflux pumps. This clearly underlines their key role in the adaptive response to toluene. In comparison to liquid medium, cells in soil drastically changed the expression of genes involved in membrane functioning (e.g., lipid composition, lipid metabolism, cell fatty acid synthesis), osmotic stress response (e.g., polyamine or trehalose synthesis, uptake of potassium), and putrescine metabolism, highlighting the adaptive mechanisms of P. veronii to readjust its metabolism to sand.
In the next chapter, I focused on understanding the potential changes in the P. veronii global transcriptome during actual growth and survival (stationary phase) in contaminated soils. In addition, I aimed to investigate differences in behaviour among three different non-sterile soils and a historically contaminated material with (polycyclic) aromatic hydrocarbons. I showed that P. veronii established itself in all except one soil, at the expense of toluene. The strain also grew in its absence of toluene but to a lower population density. This indicates its capacity to survive in real field conditions under contamination stress. I compared the transcriptomic responses during transition phase, exponential growth and stationary phase among the soils and to the behaviour induced in regular liquid culture or inert silica matrix. The transcriptomic analysis revealed that P. veronii displayed a versatile global program, characterized by commonly shared and soil-specific strategies, and signs of nutrient limitations in later growth phases, which explain its behaviour in the soil environments. We also observed a strikingly conserved core metabolic expression in the exponential phase irrespective of the growth environment. The non-growth in one soil that carried the highest resident background microbial community may be the result of predation by higher loads of resident protists, and/or of possible competition for substrate by resident microbes. In the absence of sizeable P. veronii population, however, I did not manage to isolate sufficient RNA for transcriptomics, and signs of predatory or competition stress could thus not be uncovered.
Finally, in the third chapter, I focused on characterizing the genes that might be important for growth and survival of P. veronii in (contaminated) soils. For this I used a transposon-insertion scanning approach. With help I generated two independent genome-wide insertion libraries of P. veronii through conjugation of a non-replicating hyperactive mini-Tn5 delivering an aph gene insertion (Kanamycin resistance gene). I inoculated the libraries then either in liquid suspended culture media or in two different soils under presence of toluene. Libraries were propagated for 50 generations in the same environments. Deep sequencing of amplified boundaries between the inserted aph- and host genes, served to quantify the relative abundances of insertions over time and condition. Fitness importance of genes for soil growth and survival was assessed from de- or increases of the relative abundance of insertions over generation times, and compared to random insertion models. Apart from typically considered ‘essential’ genes that were mostly absent already in the starting libraries, our data showed only a small number of genes implicated in fitness loss, that were overlapping between both soils and absent from liquid growth. These pointed to crucial functions of urea and short-chain fatty acid metabolism, oxidative stress defense, and nutrient/element transport for soil growth. Our analysis also showed that mutants inactivating flagella biosynthesis and motility had a strong fitness gain in soils. Long-term soil growth and survival of P. veronii in soils is thus a function of a variety of independent genes, but not necessarily of a coherent ‘soil-specific’ growth program.
The results obtained in my thesis enabled to draw a global picture of the natural behavior, strategies, and capabilities of P. veronii to grow and survive under environmentally relevant conditions, such as posed by non-sterile and polluted soils.
By comparing transcriptomic responses in different soils and materials, together with the transposon mutagenesis scanning at different growth phases, I am confident to have covered a broad range of conditions and scenarios that help our understanding of the mechanisms necessary for strain adaptation and survival upon inoculation. The integration of the results obtained throughout the above-described chapters showed that P. veronii is a robust strain. Its fast adaptability is explained by the large and redundant genome, which encodes several mechanisms to maintain its main central core metabolism despite the environment it is inoculated and to adjust efficiently to the constantly changing soil conditions. Finally, this work also shows evidence of possible reasons for which P. veronii would not be able to invade complex microbiomes.
RÉSUMÉ
La bioaugmentation utilise les capacités de certaines bactéries inoculées dans un site contaminé pour améliorer la dégradation de polluants. Ce procédé implique l’introduction des bactéries qui peuvent exercer leurs propriétés métaboliques et d’adaptation pour survivre et prospérer dans le site contaminé en utilisant le polluant comme source de carbone, nutriment et énergie. La plupart des connaissances à propos de l’activité de biodégradation proviennent des expériences menées en conditions de laboratoire. Cependant, les tentatives pour démontrer le potentiel pour la bioaugmentation de ces bactéries sur site ont montré des réussites, mais aussi des échecs, sans vraiment que l’on comprenne les raisons ou mécanismes de ces résultats.
Nous croyons nécessaire une meilleure compréhension des processus qui ont lieu pendant l’invasion des bactéries inoculées dans des environnements complexes comme le sont les sites contaminés. De cette façon, on pourrait identifier les « problèmes » de la bioaugmentation et pouvoir ainsi exploiter au mieux la diversité naturelle des bactéries capables de dégrader des polluants. Dans ce contexte, le principal objectif de ce travail était d’étudier de façon rationnelle la capacité de survie et les stratégies métaboliques et physiologiques de la bactérie Pseudomonas veronii 1YdBTEX2 (qui dégradent les BTEX). On les a comparé pendant l'adaptation et l'invasion de cette bactérie dans les sols naturels non stériles et contaminés, avec celle des cultures en suspension dans des liquides pollués ou des matériaux poreux standardisés.
Dans l’introduction général, je présente l’état des connaissances en bioremédiation de sols et le concept du bioaugmentation. En particulier je décris la dégradation de composants BTEX (Benzène, Toluène, Éthylbenzène et Xylènes), qui sont des substances volatiles très toxiques.
Dans le premier chapitre de recherche, je me focalise sur la compréhension des réponses adaptatives de P. veronii 1YdBTEX2 pendant la transition de cultures liquides à des sols contaminés. Dans cette optique, j’ai étudié les changements à court terme (1 heure) de l’expression de gènes des bactéries inoculées dans le sable non stérile, versus des cultures liquides ; dans les deux cas, en présence ou absence de toluène. Au cours d’un travail collaboratif, nous avons amélioré la séquence génomique de P. veronii 1YdBTEX2 et nous avons montré qu’en réalité, il est composé de trois réplicons individuels avec une taille de 8 Mb et qui inclut une large proportion de gènes avec des fonctions inconnues. Une heure d’exposition au toluène, en culture liquide ou au sol, déclenche une transcription massive (induction jusqu’à 208 fois) de multiples groupes de gènes, comme codant par exemple les voies métaboliques de dégradation du toluène, la chimiotaxie ou les pompes d’efflux de toluène. Ces résultats montrent clairement le rôle clé d’une réponse adaptative au toluène. Comparativement au milieu liquide, les cellules dans le sol changent drastiquement l’expression des gènes impliqués dans le fonctionnement de la membrane (comme par exemple, la composition et métabolisme des graisses et la synthèse des acides gras dans la cellule), la réponse au stress osmotique (par exemple, la synthèse de polyamines ou tréhalose, et l’absorption de potassium) et le métabolisme de la putrescine, mettant en évidence les mécanismes adaptatives de P. veronii pour réajuster son métabolisme au sable.
Dans le chapitre suivant je tente de comprendre le changements du transcriptome global de P. veronii pendant la croissance et survie à long terme (phase stationaire) dans des sols contaminés. En outre, j’ai cherché à étudier les différences de comportement dans 3 types de sols non stériles et un « sol » historiquement contaminé avec des hydrocarbures aromatiques polycycliques. J’ai constaté que P. veronii arrive à s’établir dans tous, sauf un, au détriment du toluène. La souche croit aussi en absence de toluène, mais avec une densité de population moindre. Ces résultats montrent une capacité de survie dans des conditions réelles de terrain, sous le stress de la contamination. J’ai comparé les réponses du transcriptome pendant la phase de transition (court terme) ainsi que la croissance exponentielle et stationnaire dans le sol avec le comportement induit dans les cultures liquides ou dans une matrice de silice inerte. L’analyse révèle un programme global et versatile de P. veronii, caractérisé par des stratégies communes ou spécifiques au sol et des évidences de limitation de nutriments dans les phases de croissance tardives, ce qui explique son comportement dans les environnements du sol. Nous avons aussi observé une expression métabolique centrale remarquablement conservée dans la phase exponentielle, sans distinction de l’environnement de croissance. L’absence de croissance dans un des sols, qui contenait une communauté complexe de microbes, est peu être le résultat de prédation de la part d’une abondante présence de protistes résidants et/ou une possible compétition pour le substrat par les microbes déjà présents. En raison de la quantié insuffisante de P. veronii pour extraire suffisamment d’ARN pour l’analyse du transcriptome, des signes de prédation ou de stress compétitif n’ont pas pu être élucidés.
Finalement, dans le quatrième chapitre, j’ai caractérisé les gènes qui pourraient être importants pour la croissance et la survie de P. veronii dans les sols (contaminés). Pour ce faire, j’ai utilisé la technique des insertions massives de transposons. De cette manière, on a pu générer deux librairies indépendantes d’insertions de transposons dans tout le génome de P. veronii à travers l’utilisation d’un transposon mini-Tn5 hyperactive non réplicatif avec un gène (aph) qui confère de la résistance a la kanamycine. Ces librairies on été inoculées dans un milieu de culture liquide et dans deux sols différents en présence de toluène et on les a laissées se propager pendant 50 générations dans le même environnement. Le séquençage profond des limites amplifiées entre l’insertion du gène aph et les gènes de la bactérie ont servi à quantifier la relative abondance des insertions en fonction du temps et des conditions de croissance. L'importance de la valeur adaptative des gènes pour la croissance et la survie au sol a été évaluée à partir de la diminution ou de l'augmentation de l'abondance relative des insertions au cours des générations, et comparée à des modèles d'insertion aléatoire. En excluant les gènes typiquement considérés comme essentiels qui ont été majoritairement absents dans les librairies de départ, nos résultats montrent seulement un petit nombre de gènes impliqués dans la perte de valeur adaptative communs aux deux sols et absents de la culture liquide. Ces résultats indiquent des fonctions cruciales du métabolisme de l’urée et des acides gras à chaîne courte, de la défense contre le stress oxydatif et du transport des nutriments/éléments pour la croissance au sol. Notre analyse a aussi montré que les mutants qui inactivent la biosynthèse des flagelles et la motilité ont un fort gain de valeur adaptative dans le sol. La croissance et survie à long terme de P. veronii dans le sol est plutôt en fonction d’une variété des gènes indépendants et pas nécessairement d’un programme cohérent spécifique au sol.
Les résultats obtenus dans ma thèse permettent de dessiner un tableau global du comportement naturel, des stratégies et de la capacité de P. veronii à croitre et à survivre dans des conditions environnementales particulières telles que celles des sols non stériles et pollués. En comparant les réponses transcriptomiques dans diffèrent sols et matériaux et le scan de mutants par transposon en différentes phases de croissance, je pense avoir couvert une ample variété de conditions et de scenarii qui aident à notre compression des mécanismes nécessaires à l’adaptation de la souche et à la survie après inoculation. L’intégration de l’ensemble des résultats montrent que P.veronii est une souche robuste, sa prompte adaptabilité est expliquée par son large et redondant génome qui code plusieurs mécanismes pour maintenir son métabolisme principal, malgré l’environnement où il est inoculé, en s’ajustant de manière efficace aux conditions changeantes du sol. Finalement, ce travail met en évidence des possibles raisons pour lesquelles P. veronii ne serait pas en mesure d’envahir des microbiomes complexes.