ANALYSIS OF FACTORS INVOLVED IN EPIDERMAL PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION
Details
Serval ID
serval:BIB_377733322379
Type
PhD thesis: a PhD thesis.
Collection
Publications
Institution
Title
ANALYSIS OF FACTORS INVOLVED IN EPIDERMAL PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION
Director(s)
Huber M.
Institution details
Université de Lausanne, Faculté de biologie et médecine
Address
Faculté de biologie et de médecineUniversité de LausanneCH-1015 LausanneSUISSE
Publication state
Accepted
Issued date
2016
Language
english
Abstract
The protein named homeodomain only protein homeobox (HOPX) is the smallest known member of the Homeodomain (HD)-containing protein family. In contrast to other HD- containing protein members, HOPX is unable to bind DNA. HOPX is widely expressed in diverse tissues, where it is critically involved in the balance between cell prolifération and differentiation. HOPX seems to play a rôle as a tumor suppressor, being downregulated or absent in numerous malignant tissues. In skin, HOPX controls epidermal formation through the régulation of late differentiation markers like filaggrin (FLG) and loricrin (LOR). HOPX is significantly expressed in SCCs, while it is absent in BCCs. Hopx is also a marker of a quiescent stem cell population in mouse hair follicles. At present, how HOPX regulates these pathways, and which proteins interact with HOPX remains unknown.
The aim of thefirst part of the study wasto understand cellular mechanisms regulated by HOPX, by identifying HOPX ligands in vitro. A human HOPX recombinant protein was constructed, carrying an N-terminal 106 amino acid long tag, consisting of six histidines, a TEV cleavage site and a biotin acceptor site. Recombinant HOPX was overexpressed in both HeLa cells and primary keratinocytes and purified by using a double-step purification technique. Some potential HOPX-binding proteins
were isolated, but need to be further validated. To test alternative methods to purify HOPX ligands, two additional HOPX recombinant proteins were constructed, carrying a C-terminal HA-BirA tag or a FLAG tag, respectively. One-step protein purification assays followed by mass spectrometry analysis will be performed to finally identify HOPX ligands.
The purpose of the second part of the study was to investigate the rôle of Hopx during in vivo epidermal homeostasis and barrier formation. Svl29/C57BL6 mice, in which the coding région for Hopx was replaced with a lacZ cassette, were used (Hopx ko mice). X-gal stainings showed Hopx localization in the granular layer at PO, while being expressed in hair follicles at P16 and P28, and in hair follicle basai bulges at P19. Hopx ko mice exhibited a significantly decreased epidermal thickness at PO compared to wt mice, as well as a significantly lower expression of FLG and LOR at PO and P28. Comparable expression levels of FLG and LOR were observed in 3 months old wt and ko mice.
Moreover, P15 wt mice exhibited significantly higher transepidermal water loss (TEWL) after cutaneous barrier perturbation compared to ko mice. These data demonstrates that Hopx might play a transient raie in the early stages of epidermal barrier formation and recovery.
The aim of the third part of the study was to investigate the raie of Hopx in in vivo skin carcinogenesis. Sv129/C57BL6 Hopx ko and wt females were subjected to DMBA/TPA chemical carcinogenesi s. At early time points, the percentage of mice with tumors, as well as the number of papillomas per mouse, was higher in wt rnice compared to ko. Thirty weeks after initiation, all tumors collected from bath groups were classified as papillomas. Taken together, these data demonstrates that Hopx does not seem to act as a tumor suppressor in skin carcinogenesis. ln contrast, Hopx seems rather to act as an oncogene during early stages of mouse skin carcinogenesis.
--
La protéine HOPX (Homeodomain Only Protein Homeobox) est la plus petite protéine au sein de la famille des protéines contenant un homéodomaine (HD). Contrairement aux autres protéines HD, HOPX est incapable de se lier à l'ADN. HOPX est produite dans divers tissus, où elle est impliquée dans l'équilibre entre la prolifération et la différenciation des cellules. HOPX joue apparemment un rôle de suppresseur de tumeur, car elle est absente dans de nombreux tissus malins. Dans la peau, cette protéine contrôle la formation de l'épiderme en régulant les gènes codant pour des marqueurs de différenciation tardive comme la filaggrine (FLG) et la loricrine (LOR). HOPX est fortement exprimée dans le carcinome spinocellulaire, alors qu'elle n'a pas été mise en évidence dans les carcinomes basocellulaires. Hopx est aussi un marqueur d'une population de cellules souches dans les follicules pileux de souris. À ce jour, comment HOPX réglemente ces voies de différentiation demeure une question, et les protéines qui interagissent avec HOPX sont encore inconnues.
L'objectif de la première partie de cette étude était de comprendre les mécanismes cellulaires qui sont régulés par HOPX en identifiant des ligands qui se lient à HOPX in vitro. Une protéine HOPX humaine a été synthétisée de manière recombinante avec un tag de 106 acides aminés à son N- terminus. Ce tag comprenait un bloc de six résidus histidine, un site de clivage TEV (Tobacco Etch Virus) et un site accepteur de biotine. Le gène codant pour cette protéine recombinante a été surexprimé dans les cellules HeLa et dans des kératinocytes primaires, et la protéine a été ensuite purifiée. Des protéines pouvant potentiellement se lier à HOPX ont été isolées, mais les affinités de ces protéines avec HOPX doivent encore être démontrées. Alternativement, nous avons construit deux protéines recombinantes HOPX supplémentaires, portant à son extrémité C-terminale soit un tag HA-BirA* soit un tag FLAG. Ainsi, des essais de purification de protéine pourront être effectués, et ensuite des analyses par spectrométrie de masse pourront être réalisées pour identifier les ligands à HOPX.
Le but de la deuxième partie du projet était d'étudier le rôle de HOPX lors de l'homéostasie épidermique et la formation de la barrière cutanée in vivo. Des souris Svl29/C57BL6 ont été utilisées.
Dans ces souris, la région codant pour Hopx a été entièrement remplacée par une cassette lacZ (Hopx ko). Des colorations X-gal ont montré que Hopx était localisée dans la couche granulaire à la naissance de ces souris (PO). Cependant, Hopx était exprimée dans les follicules pileux au jour 16 (P16) et au jour 28 (P28), ainsi qu'au jour 19 (P19) dans les bourrelets des follicules pileux de base. Les mêmes souris ont montré une diminution significative de l'épaisseur épidermique au PO en comparaison des souris de type sauvage (wt). Les gènes codant pour la FLG et la LOR ont étés aussi trouvés significativement moins exprimés dans ces souris Hopx ko, au PO et au P28. Des niveaux comparables d'expression de la FLG et de la LOR ont été observés dans souris wt et ko à l'âge de 3 mois. En outre, les souris wt présentaient à l'âge de 15 jours (P15) une perte d'eau transépidermique (TEWL) significativement plus élevée après une perturbation de la barrière cutanée par rapport aux souris Hopx ko. En conclusion, Hopx pourrait jouer un rôle dans les premières étapes de la formation de l'épiderme et de la barrière cutanée.
L'objectif de la troisième partie de l'étude était d'étudier le rôle de Hopx dans la carcinogenèse de la peau in vivo. Des souris femelles Svl29/C57BL6 wt et Hopx ko ont été soumises à un traitement de cancérogenèse chimique en utilisant du DMBA/TPA. À un stade précoce, le pourcentage de souris présentant des tumeurs, ainsi que le nombre de papillomes par souris, a été plus élevé dans les souris wt en comparaison aux souris Hopx ko. Trente semaines après le début de l'expérience, toutes les tumeurs collectées à partir des deux groupes traitées étaient des papillomes. En conclusion, Hopx ne semble pas agir comme un suppresseur au niveau de la carcinogenèse de la peau. Au contraire, Hopx semble agir comme un oncogène aux stades précoces
The aim of thefirst part of the study wasto understand cellular mechanisms regulated by HOPX, by identifying HOPX ligands in vitro. A human HOPX recombinant protein was constructed, carrying an N-terminal 106 amino acid long tag, consisting of six histidines, a TEV cleavage site and a biotin acceptor site. Recombinant HOPX was overexpressed in both HeLa cells and primary keratinocytes and purified by using a double-step purification technique. Some potential HOPX-binding proteins
were isolated, but need to be further validated. To test alternative methods to purify HOPX ligands, two additional HOPX recombinant proteins were constructed, carrying a C-terminal HA-BirA tag or a FLAG tag, respectively. One-step protein purification assays followed by mass spectrometry analysis will be performed to finally identify HOPX ligands.
The purpose of the second part of the study was to investigate the rôle of Hopx during in vivo epidermal homeostasis and barrier formation. Svl29/C57BL6 mice, in which the coding région for Hopx was replaced with a lacZ cassette, were used (Hopx ko mice). X-gal stainings showed Hopx localization in the granular layer at PO, while being expressed in hair follicles at P16 and P28, and in hair follicle basai bulges at P19. Hopx ko mice exhibited a significantly decreased epidermal thickness at PO compared to wt mice, as well as a significantly lower expression of FLG and LOR at PO and P28. Comparable expression levels of FLG and LOR were observed in 3 months old wt and ko mice.
Moreover, P15 wt mice exhibited significantly higher transepidermal water loss (TEWL) after cutaneous barrier perturbation compared to ko mice. These data demonstrates that Hopx might play a transient raie in the early stages of epidermal barrier formation and recovery.
The aim of the third part of the study was to investigate the raie of Hopx in in vivo skin carcinogenesis. Sv129/C57BL6 Hopx ko and wt females were subjected to DMBA/TPA chemical carcinogenesi s. At early time points, the percentage of mice with tumors, as well as the number of papillomas per mouse, was higher in wt rnice compared to ko. Thirty weeks after initiation, all tumors collected from bath groups were classified as papillomas. Taken together, these data demonstrates that Hopx does not seem to act as a tumor suppressor in skin carcinogenesis. ln contrast, Hopx seems rather to act as an oncogene during early stages of mouse skin carcinogenesis.
--
La protéine HOPX (Homeodomain Only Protein Homeobox) est la plus petite protéine au sein de la famille des protéines contenant un homéodomaine (HD). Contrairement aux autres protéines HD, HOPX est incapable de se lier à l'ADN. HOPX est produite dans divers tissus, où elle est impliquée dans l'équilibre entre la prolifération et la différenciation des cellules. HOPX joue apparemment un rôle de suppresseur de tumeur, car elle est absente dans de nombreux tissus malins. Dans la peau, cette protéine contrôle la formation de l'épiderme en régulant les gènes codant pour des marqueurs de différenciation tardive comme la filaggrine (FLG) et la loricrine (LOR). HOPX est fortement exprimée dans le carcinome spinocellulaire, alors qu'elle n'a pas été mise en évidence dans les carcinomes basocellulaires. Hopx est aussi un marqueur d'une population de cellules souches dans les follicules pileux de souris. À ce jour, comment HOPX réglemente ces voies de différentiation demeure une question, et les protéines qui interagissent avec HOPX sont encore inconnues.
L'objectif de la première partie de cette étude était de comprendre les mécanismes cellulaires qui sont régulés par HOPX en identifiant des ligands qui se lient à HOPX in vitro. Une protéine HOPX humaine a été synthétisée de manière recombinante avec un tag de 106 acides aminés à son N- terminus. Ce tag comprenait un bloc de six résidus histidine, un site de clivage TEV (Tobacco Etch Virus) et un site accepteur de biotine. Le gène codant pour cette protéine recombinante a été surexprimé dans les cellules HeLa et dans des kératinocytes primaires, et la protéine a été ensuite purifiée. Des protéines pouvant potentiellement se lier à HOPX ont été isolées, mais les affinités de ces protéines avec HOPX doivent encore être démontrées. Alternativement, nous avons construit deux protéines recombinantes HOPX supplémentaires, portant à son extrémité C-terminale soit un tag HA-BirA* soit un tag FLAG. Ainsi, des essais de purification de protéine pourront être effectués, et ensuite des analyses par spectrométrie de masse pourront être réalisées pour identifier les ligands à HOPX.
Le but de la deuxième partie du projet était d'étudier le rôle de HOPX lors de l'homéostasie épidermique et la formation de la barrière cutanée in vivo. Des souris Svl29/C57BL6 ont été utilisées.
Dans ces souris, la région codant pour Hopx a été entièrement remplacée par une cassette lacZ (Hopx ko). Des colorations X-gal ont montré que Hopx était localisée dans la couche granulaire à la naissance de ces souris (PO). Cependant, Hopx était exprimée dans les follicules pileux au jour 16 (P16) et au jour 28 (P28), ainsi qu'au jour 19 (P19) dans les bourrelets des follicules pileux de base. Les mêmes souris ont montré une diminution significative de l'épaisseur épidermique au PO en comparaison des souris de type sauvage (wt). Les gènes codant pour la FLG et la LOR ont étés aussi trouvés significativement moins exprimés dans ces souris Hopx ko, au PO et au P28. Des niveaux comparables d'expression de la FLG et de la LOR ont été observés dans souris wt et ko à l'âge de 3 mois. En outre, les souris wt présentaient à l'âge de 15 jours (P15) une perte d'eau transépidermique (TEWL) significativement plus élevée après une perturbation de la barrière cutanée par rapport aux souris Hopx ko. En conclusion, Hopx pourrait jouer un rôle dans les premières étapes de la formation de l'épiderme et de la barrière cutanée.
L'objectif de la troisième partie de l'étude était d'étudier le rôle de Hopx dans la carcinogenèse de la peau in vivo. Des souris femelles Svl29/C57BL6 wt et Hopx ko ont été soumises à un traitement de cancérogenèse chimique en utilisant du DMBA/TPA. À un stade précoce, le pourcentage de souris présentant des tumeurs, ainsi que le nombre de papillomes par souris, a été plus élevé dans les souris wt en comparaison aux souris Hopx ko. Trente semaines après le début de l'expérience, toutes les tumeurs collectées à partir des deux groupes traitées étaient des papillomes. En conclusion, Hopx ne semble pas agir comme un suppresseur au niveau de la carcinogenèse de la peau. Au contraire, Hopx semble agir comme un oncogène aux stades précoces
Create date
02/09/2016 10:39
Last modification date
20/08/2019 14:25