Microorganisms are ubiquitous in nature and seldom occur alone. Rather, they live in complex, multi-species communities. Microbial species interact with each other within communities and respond to non-biological environmental factors and conditions such as temperature, availability of nutrients, pH, or humidity. The participation of microbial communities in the maintenance of our planetary ecosystems is quite significant. They further have important roles in health, plant productivity, food and environmental biotechnology and sustainability. Although the roles of microbial communities become more and more clear, key features of their development, evolution and maintenance, or in the emergence of community functions remain elusive. In this thesis, we made progress to better understand how microbial species interact with each other within communities, and its effects on partner and community growth.
After a more general introduction, in Chapter 2, we developed a method to study pair- wise growth interactions between soil microorganisms and potential bacterial inoculants of interest for microbial community engineering. Better understanding of microbial inoculant behaviour may help to better restoration or design of synthetic communities, for example, in bioremediation. We achieved a suitable method by randomly encapsulating individual cells of pure culture inoculants with those of a soil microbial community in thousands of agarose beads simultaneously. As inoculants, we used Pseudomonas veronii 1YdBTEX2 and Pseudomonas putida F1, species that can degrade toxic pollutants like toluene, and further Pseudomonas protegens CHA0, a plant-growth promoting bacterium, and Escherichia coli MG1655, as non-specific inoculant. Encapsulated beads were incubated in the presence of different carbon growth substrates for periods of up to 3 days, during which beads were sampled for partner growth. Growth was deduced in beads by epifluorescence microscopy and image analysis with custom-developed computer algorithms. Through differential fluorescence staining inoculants could be identified from soil bacteria, across hundreds of agarose beads simultaneously. Our results indicated that a large proportion of soil community bacteria developed better in close proximity to an inoculant cell, almost irrespective of the nature of the inoculant, whereas the paired inoculant cells grew less than when incubated alone. Also soil bacteria themselves grew better in random pairs than alone in agarose beads, on the same media. These results thus suggested benefits of adding inoculants to existing soil microbial community for enhancing growth, and further suggested that many soil bacteria need partners for productive growth.
In Chapter 3, we studied influence of inoculants on expansive surface growth of soil- derived microbial communities on artificial surfaces. The design of the encapsulation method in Chapter 2 forced paired cells to grow within a confined space without much chance for expansion or contact to further species. On surfaces, cells may further expand via water films. At first, we studied how two strains of Pseudomonas compete for a common limited resource. We learned how the difference in growth rate can bring competitive advantage for resources and space. The experiments on surfaces differed from conventional liquid suspension by having equally distributed nutrients. We observed that in the presence of the toxic carbon source toluene the soil microbial cells grew better in neighborhood of the inoculant Pseudomonas veronii than without. Soil microbial growth was not affected by the presence of inoculant in case of the regular carbon substrate succinate. We demonstrated that agarose surfaces can be a complementary approach to the encapsulation approach to study interactions in complex niches.
In the fourth Chapter, we studied substrate competition between two Pseuomonas sp. more in detail, asking in particular if competition would be conditional or a permanent character between species. Our results showed that interactions between Pseudomonas veronii 1YdBTEX2 and Pseudomonas putida F1 are context- dependent. In liquid suspension on single limited resources (succinate or toluene), P. putida outcompeted P. veronii in all instances, which was solely due to differences in growth rate and yield. In contrast, in microcosms with long (7 days) air-dried soil and toluene as carbon substrate, P. veronii developed faster and P. putida only grew in presence of P. veronii. Although we could not discern the underlying factors determining this behaviour, it showed that context-dependent competition is existing. Therefore, context- dependency to species interactions should be considered in theoretical studies modeling species behaviour in communities.
Overall, our results contributed to better understanding of the intricacy of microbial interactions within communities and to development of new tools to study interaction effects in engineering communities through inoculants. We hope to see continuation of such efforts in the future and translation of the core principles in making sustainable changes.
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Les microorganismes sont omniprésents dans la nature et vivent rarement seuls. Au contraire, ils coexistent et interagissent au sein des communautés complexes comprenant de multiples espèces. Également, ils répondent à des facteurs environnementaux non biologiques tels que la température, la disponibilité des éléments nutritifs, le pH ou l'humidité. La participation des communautés microbiennes au maintien de nos écosystèmes planétaires est assez importante. En outre, ils jouent un rôle important dans la santé, la productivité des plantes, la biotechnologie alimentaire et environnementale et la durabilité. Bien que les rôles des communautés microbiennes deviennent de plus en plus clairs, les caractéristiques essentielles de leur développement, de leur évolution et de leur maintien, ou de l’émergence de fonctions communautaires restent obscures. Au cours de ce travail, nous avons progressé dans la compréhension des interactions entre espèces microbiennes au sein des communautés, et de leurs effets sur la croissance des partenaires et des communautés.
Après une introduction plus générale, au chapitre 2, nous avons développé une méthode pour étudier les interactions de croissance par paires entre les microorganismes du sol et les inoculants bactériens présentant un intérêt potentiel pour l’ingénierie de la communauté microbienne. Une meilleure compréhension du comportement des inoculants microbiens peut aider à améliorer la restauration ou la conception des communautés synthétiques, par exemple lors de la biorestauration. Notre méthode repose sur (co)encapsulation aléatoire des cellules individuelles à partir d’une culture pure d'inoculant d’intérêt, et de cellules de communautés microbiennes du sol dans des milliers de billes d'agarose. Comme inoculants d’intérêt, nous avons utilisé Pseudomonas veronii 1YdBTEX2 et Pseudomonas putida F1, des espèces capables de dégrader des polluants toxiques comme le toluène, ainsi que Pseudomonas protegens CHA0, un bactérie favorisant la croissance des plantes. Escherichia coli MG1655 a été choisi comme contôle en tant qu’inoculant non spécifique. Les billes encapsulées ont été incubées en présence de différentes sources de carbone pendant des périodes allant jusqu'à 3 jours, au cours desquelles des billes ont été échantillonnées afin d’évaluer la croissance des partenaires. La croissance au sein des billes a été estimée par analyse d'images de microscopie à épifluorescence à l'aide d'algorithmes informatiques développés sur mesure. Grâce à la coloration différentielle par fluorescence, les inoculants ont pu être différenciés des bactéries du sol à travers des centaines de billes d'agarose simultanément. Nos résultats ont montré qu'une grande partie des bactéries de la communauté du sol se développait mieux à proximité d'une cellule de l’inoculant d’intérêt, presque indépendamment de la nature de l'inoculant d’intérêt. De plus, les bactéries du sol elles-mêmes se sont développées mieux en combinaisons aléatoires que seules dans des billes d'agarose, sur le même support. Les cellules de l’inoculant se développaient moins bien en combinaison avec les bactéries du sol que lorsqu'elles étaient incubées seules. Ces résultats suggérent donc que l'ajout d'inoculants à la communauté microbienne de sol existante présente un avantage pour améliorer sa croissance. Cela suggère également que de nombreuses bactéries du sol ont besoin de partenaires pour une assurer une bonne croissance.
Au chapitre 3, nous avons étudié l'influence des inoculants sur la croissance expansive de communautés microbiennes dérivées du sol sur des surfaces artificielles. La conception de la méthode d’encapsulation du chapitre 2 a forcé les cellules à se développer seules ou en combinaison dans un espace confiné sans grande chance d’expansion ou de contact avec d’autres espèces piégées dans d’autres billes. Sur les surfaces planes, les cellules peuvent se développer davantage via des films d’eau. Au début, nous avons étudié la façon dont deux souches de Pseudomonas se font concurrence pour une ressource commune limitée. Nous avons appris comment la différence de taux de croissance peut apporter un avantage concurrentiel pour les ressources et l'espace. Les expériences sur les surfaces diffèrent de la suspension liquide conventionnelle par la distribution égale de nutriments. Nous avons observé qu'en présence de toluène comme unique source de carbone et composé toxique, les cellules microbiennes du sol se développaient mieux au voisinage de Pseudomonas veronii. La croissance microbienne du sol n'a pas été affectée par la présence d'inoculant dans le cas du succinate de substrat de carbone régulier. Nous avons démontré que les surfaces d'agarose peuvent constituer une approche complémentaire de l'approche par encapsulation pour étudier les interactions dans des niches complexes.
Dans le quatrième chapitre, nous avons étudié la compétition entre deux espèces de Pseudomonas pour un substrat, notamment afin d’élucider si la concurrence serait conditionnelle ou permanente entre les espèces. Nos résultats ont montré que les interactions entre Pseudomonas veronii 1YdBTEX2 et Pseudomonas putida F1 dépendent du contexte. En suspension liquide sur des ressources limitées uniques (succinate ou toluène), la productivité de P. putida a toujours été supérieure à P. veronii, uniquement en raison de différences de taux de croissance et de rendement. Au contraire, dans les microcosmes du le sol séché à l'air longtemps (7 jours) et le toluène comme substrat carboné, P. veronii s'est développé plus rapidement et P. putida ne s'est développé qu'en présence de P. veronii. Bien que nous ne puissions pas discerner les facteurs sous-jacents qui déterminent ce comportement, cela montre qu’une concurrence dépendante du contexte existe. Par conséquent, la dépendance du contexte lors d’interactions entre espèces devrait être prise en compte dans les études théoriques modélisant le comportement des espèces dans les communautés.
Globalement, nos résultats ont contribué à une meilleure compréhension de la complexité des interactions microbiennes au sein des communautés et au développement de nouveaux outils pour étudier les effets d'interactions dans les communautés microbiennes modifiées par le biais d'inoculants. Nous espérons voir ces efforts perdurer et se traduire par des changements durables basés sur les principes fondamentaux que nous avons mis en évidence.