Spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3) is a rare neurodegenerative disease caused by an unstable CAG repeat expansion within the exon 10 of Ataxin-3 gene (ATXN3). The accumulation of mutant ataxin-3 protein in neurons leads to prominent cell death in the cerebellum and other brain regions. SCA3 patients present with cognitive and motor symptoms, which worsen with disease progression. Being the monogenic disease with only symptomatic treatment available, ATXN3 represents an attractive therapeutic target for gene editing.
Here, we implemented CRISPR-Cas9 system for ATXN3 editing as a potential SCA3 therapy. We explored a non allele-specific approach, such that all SCA3 patients would be eligible. Three distinct strategies were proposed: (1) Exon 10 deletion -employing dual sgRNA system leading to the removal of exon 10 encoding the CAG repeat; (2) Exon 9 truncation – generating a premature stop codon at the end of this exon. Both strategies would generate a truncated protein like naturally occurring enzymatically active isoforms; (3) Ablate and replace – using a sgRNA targeting ATXN3 close to its translational start site, leading to its complete inactivation, since no deleterious phenotype was associated with the absence of this gene in knock-out mice. To prevent potential detrimental effects of ataxin-3 ablation, a CRISPR- resistant replacement vector encoding the human ATXN3 with 27 CAG repeats was expressed.
Following the in vitro functionality assessment of the sgRNAs, the selected candidates were evaluated in the cerebellum of SCA3 transgenic mice (MJD84.2 mice). To facilitate efficient and targeted delivery, we harnessed the AAV2/rh.10 serotype with high diffusion properties via both anterograde and retrograde neuronal transport through injection into deep cerebellar nuclei. Employing a digital PCR-based assay to accurately quantify deletion events, we showed absence of exon 10 deletion in vivo. These observations did not support therapeutic potential of the deletion strategy with dual sgRNA system. When targeting the exon 9 in the mouse cerebellum, editing efficiency at background levels was recorded, in disagreement with the in vitro outcomes. It remains unclear whether it was due the sgRNA efficiency itself, or other biological reasons such chromatin structure. In the ablation strategy, we reached high editing efficiency of both wild-type mouse and mutant human ATXN3 up to
72.8 %. We were also able to overexpress the replacement vector with CRISPR-resistant
ATXN3.
Lastly, we adapted the previously described self-deleting KamiCas9 system to ATXN3 targeting. We aimed to trigger transient Cas9 expression while maintaining the on-target performance. Using a new promoter driving the sgRNA targeting the Cas9 combined with the ablate strategy, we showed that the KamiCas9 is leading to decreased on-target efficiency. This eventually led to optimization of the promoters and tracrRNAs comprising the system to equilibrate its kinetics, which is to be evaluated in vivo. Together, this project establishes a potent system for ATXN3 editing in the mouse cerebellum, underpinning a promising therapeutic option for future clinical applications.
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L'ataxie spinocérébelleuse de type 3 (SCA3) est une maladie neurodégénérative rare causée par une expansion instable de répétitions CAG dans l'exon 10 du gène Ataxine-3 (ATXN3). L'accumulation de la protéine mutante ataxine-3 dans les neurones entraîne une mort cellulaire importante dans le cervelet et d'autres régions du cerveau. Les patients atteints de SCA3 présentent des symptômes cognitifs et moteurs qui s'aggravent avec la progression de la maladie. Étant donné qu'il s'agit d'une maladie monogénique pour laquelle seul un traitement symptomatique est disponible, l'ATXN3 représente une cible thérapeutique prometteuse pour l'édition génomique.
Dans ce projet, nous avons édité le gène de l'ATXN3 en utilisant l’outil CRISPR-Cas9 en tant que thérapie potentielle de SCA3. Nous avons exploré une approche allèle-non spécifique, de sorte que tous les patients atteints de SCA3 soient éligibles pour le traitement. Trois stratégies distinctes ont été proposées : (1) délétion de l'exon 10 - utilisation de deux sgRNAs provoquant l'élimination de l'exon 10 codant pour la répétition CAG ; (2) édition de l'exon 9 générant un codon stop prématuré à la fin de cet exon. Ces deux stratégies produiraient des protéines tronquées, actives telle que des protéines isoformes ; (3) Ablation et remplacement - en utilisant un sgRNA ciblant l'ATXN3 proche de son site de l’initiation de la traduction, conduisant à l’inactivation complète de l’ataxine-3, puisqu’il semblerais qu’aucun phénotype délétère n'a été associé à l'absence de ce gène dans les souris knock-out. Pour contrecarrer les effets néfastes potentiellement dû à l'ablation de l'ataxine-3, un vecteur de remplacement résistant à CRISPR codant pour l'Ataxine-3 humaine avec 27 répétitions CAG a été exprimé.
Après l'évaluation in vitro de la fonctionnalité des sgRNAs, les candidats sélectionnés ont été évalués dans le cervelet de souris transgéniques SCA3 (souris MJD84.2). Pour cibler efficacement les noyaux cérébelleux profonds du cervelet, nous avons exploité le vecteur AAV, sérotype AAV2/rh.10, qui présente des hautes propriétés de diffusion et un transport neuronal antérograde et rétrograde. En effectuant des PCR digitales pour quantifier avec précision les événements de délétion, nous avons démontré l'absence de délétion de l'exon 10 in vivo. Ces observations n'ont pas confirmé le potentiel thérapeutique de la stratégie de délétion (1) avec les deux sgRNAs. Lors de la strategie 2, visant l'exon 9, dans le cervelet de la souris, l'efficacité de l'édition a été enregistrée à des niveaux de fond, en désaccord avec les résultats in vitro. Il n'est pas clair si cela est dû à l'efficacité du sgRNA lui-même ou à d'autres problématiques biologiques telles que la structure de la chromatine. Dans la stratégie d'ablation (3), nous avons atteint une efficacité d'édition élevée de l’Ataxine-3 humaine mutante et de l’Ataxine-3 souris wild-type, atteignant jusqu’à 72,8 %. Nous avons également pu surexprimer le vecteur de remplacement avec l'ATXN3 résistant à CRISPR.
Enfin, nous avons repris le système d’auto-inactivation de la KamiCas9 précédemment développé dans ce laboratoire, et nous l’avons adapté au gène ATXN3. Nous avons cherché à faciliter l'expression transitoire de Cas9 tout en maintenant la performance de l’édition sur
l’ATXN3. En utilisant un nouveau promoteur contrôlant le sgRNA, qui cible la Cas9, et combiné à la stratégie de l’ablation, nous avons montré que le KamiCas9 mène à une diminution de l'efficacité de l’édition de l’ATXN3. Cela a finalement conduit à l'optimisation des promoteurs et des tracrRNAs du sgRNA ciblant la Cas9 afin d’équilibrer la cinétique du système, qui devra être évalué in vivo. L'ensemble de ce projet établit un outil prometteur dans la thérapie de SCA3 dans le cervelet de la souris et dans ses futures applications cliniques.